[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因植物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980141344.1
• 申請日: 2009-08-14
• 公開（公告）號: CN102203243A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: L·瓊斯;G·利奇;S·科亞特斯
• 申請（專利權(quán)）人: 先進技術(shù)(劍橋)有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N9/12;C12N15/82
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 劉辛;郭文潔

本發(fā)明涉及用于制備轉(zhuǎn)基因植物的基因構(gòu)建體。所述構(gòu)建體可具有引起植物在其葉片中積累蘇氨酸的能力，尤其是在葉片衰老過程中。本發(fā)明擴展至使用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物細胞，以及轉(zhuǎn)基因植物本身。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，以及在衰老植物中增加蘇氨酸濃度的方法。本發(fā)明還涉及收獲的植物葉片，例如煙草葉片，其以所述基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化以及涉及包含所收獲植物葉片的吸煙制品。

提升烤煙味道的一個主要目標是生產(chǎn)氨基酸蘇氨酸。在突變體煙草植物的葉片中積累高水平蘇氨酸可產(chǎn)生顯著的味道和香氣益處。但是，通常蘇氨酸生產(chǎn)與天冬氨酸家族的其它氨基酸，即甲硫氨酸、賴氨酸和異亮氨酸的生產(chǎn)同樣被嚴格調(diào)控。因此，需要改變生產(chǎn)蘇氨酸的生物合成路徑以獲得味道和香氣益處。

如圖1和2所示，天冬氨酸激酶(AK)為將天冬氨酸轉(zhuǎn)換為包括蘇氨酸的氨基酸的植物生物合成路徑中的第一種酶。內(nèi)源天冬氨酸激酶由來自賴氨酸和蘇氨酸的反饋抑制調(diào)控。因此，需要一種不經(jīng)受反饋抑制的天冬氨酸激酶。但是，實現(xiàn)所述需求需要不強制植物進入甲硫氨酸饑餓或者消耗的天冬氨酸水平到依賴其的其它路徑受限制的程度。

以往曾顯示，包含反饋不敏感的天冬氨酸激酶的轉(zhuǎn)基因植物，與野生型植物相比可以過量生產(chǎn)蘇氨酸，其生長不良，并且如果所述植物為純合突變，會顯示災難性的適合度損害。生長不良和適合度損害是農(nóng)場主注意的植物生長中的任何不利改變。顯然任何此類改變是不可取的。

因此本發(fā)明的發(fā)明人試圖提供一種轉(zhuǎn)基因植物，其可通過克服上述反饋抑制回路在葉片中積累蘇氨酸，但理想地沒有任何適合度損害。有鑒于此，本發(fā)明人開發(fā)了多種基因構(gòu)建體，其中將編碼蘇氨酸不敏感的天冬氨酸激酶(AK)酶的基因置于一種啟動子控制之下，以確定所述基因的過量表達對衰老葉片中蘇氨酸水平有何種影響(如果有影響的話)。

葉片衰老是植物發(fā)育的一個階段，在此階段，在細胞死亡之前細胞經(jīng)歷截然不同的新陳代謝和結(jié)構(gòu)變化。生理學和遺傳學研究指出衰老是高度調(diào)控的過程。葉片經(jīng)歷衰老的進程可見的特點為失去葉綠素并隨之發(fā)黃，其由葉綠體解體引起。所述發(fā)育階段的特征，葉片葉綠素水平降低可通過例如溶劑萃取和分光光度測量或者通過葉綠素含量測定儀檢測。降低的葉片葉綠素水平與記錄的相同植物(優(yōu)選地在恒定條件下生長)早前葉片葉綠素水平相比較，顯示出衰老。

分子研究指出衰老與基因表達變化有關(guān)。衰老過程中編碼涉及光合作用的蛋白質(zhì)的mRNA水平降低，而編碼據(jù)信涉及衰老的蛋白質(zhì)的基因mRNA水平升高。衰老是由已知為衰老相關(guān)基因(SAG)的基因調(diào)控的高度有組織的過程。葉片衰老涉及蛋白質(zhì)、核酸和膜的降解，以及隨后由此降解導致的營養(yǎng)向植物其它區(qū)域輸送，例如發(fā)育中的種子、葉片或貯藏器官。植物衰老的一個問題是衰老葉片中存在的很多有用的礦物質(zhì)和營養(yǎng)會保留在葉片中，并因此會在葉片死亡時顯著丟失。例如，衰老葉片中存在的蘇氨酸以及很多其它氨基酸，如果不從將死的葉片中移除，將會浪費。

如實施例2所述，本發(fā)明人進行的實驗涉及使用在植物中特定位點表達蘇氨酸不敏感AK的基因構(gòu)建體，即，使用葉片特異性豌豆質(zhì)體藍素啟動子。但是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)此類轉(zhuǎn)基因植物的葉片蒼白、增厚、易碎且呈帶狀。節(jié)間部縮短并隨成熟度增加而顯示褐變，并且芽或者不發(fā)育或者畸形。因此，此類轉(zhuǎn)基因植物不能克服適合度損害。

因此，本發(fā)明人開發(fā)了一系列基因構(gòu)建體，其中反饋不敏感的天冬氨酸激酶(AK)活性僅在植物已進入衰老之后表達(由SAG12啟動子控制)，因此允許正常發(fā)育。本發(fā)明人觀察到所開發(fā)的構(gòu)建體，其允許使用這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物在反饋不敏感的天冬氨酸激酶(AK)啟動之前正常生長至成熟(即，至衰老)，令人驚奇地能克服適合度損害。

因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了一種基因構(gòu)建體，其包含可操作性連接到一種編碼序列的衰老特異性啟動子，所述編碼序列編碼具有蘇氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽。

本發(fā)明人使用一種衰老特異性啟動子連接到編碼序列，所述編碼序列編碼具有蘇氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽，以形成第一個方面的構(gòu)建體，然后將其用于轉(zhuǎn)化植物。作為其研究結(jié)果，本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體在衰老葉片中導致蘇氨酸水平升高。此外，由衰老特異性啟動子控制的轉(zhuǎn)基因表達的時間限制克服了之前在生產(chǎn)蘇氨酸積累植物的以往嘗試中所見的適合度損害的負面影響。如實施例所示，得到的轉(zhuǎn)基因植物在葉片衰老過程中生產(chǎn)蘇氨酸的水平高于野生型。證明在葉片中發(fā)生蘇氨酸積累，且升高的水平據(jù)信對包含所述構(gòu)建體的煙草葉片以及用所述葉片制造的吸煙制品的味道有正面貢獻。