[發明專利]存活蛋白mRNA的測定方法

無效

• 申請號: 200980139729.4
• 申請日: 2009-10-06
• 公開（公告）號: CN102171369A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發明（設計）人: 尾本大輔;齊藤壽一;大仲悟;林俊典
• 申請（專利權）人: 東曹株式會社
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/09;C12Q1/44;C12Q1/48;G01N33/53
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 苗堃;金世煜

1.一種試樣中的存活蛋白mRNA的測定方法，其特征在于，

所述測定方法使用了第一引物和第二引物，所述第一引物具有與存活蛋白mRNA中的特定堿基序列的一部分相同的序列，所述第二引物具有與特定堿基序列的一部分互補的序列，其中，第一引物或第二引物的任意一方是其5’末端添加有RNA聚合酶的啟動子序列的引物，

并且，所述測定方法包括下述工序：

(1)以RNA為模板，利用具有RNA依賴性DNA聚合酶活性的酶合成與特定堿基序列互補的cDNA的工序，

(2)利用具有核糖核酸酶H(RNaseH)活性的酶，分解所述(1)的反應中得到的RNA-DNA雙鏈的RNA的工序，即，生成單鏈DNA，

(3)以所述單鏈DNA為模板，利用具有DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶，生成具有啟動子序列的雙鏈DNA的工序，所述啟動子序列能夠轉錄所述特定堿基序列、或與所述特定堿基序列互補的序列的RNA，

(4)利用具有RNA聚合酶活性的酶，以所述雙鏈DNA為模板生成RNA轉錄產物的工序，

(5)通過該RNA轉錄產物成為所述(1)的反應中的cDNA合成的模板，從而連鎖性地生成RNA轉錄產物的工序，以及

(6)測定所述RNA轉錄產物量的工序；

并且，所述第一引物和第二引物為以下的任一種：

(i)所述第一引物是由序列號1所示的堿基序列中的至少15個連續堿基構成的寡核苷酸，所述第二引物是由序列號3所示的堿基序列中的至少15個連續堿基構成的寡核苷酸，

(ii)所述第一引物是由序列號2所示的堿基序列中的至少15個連續堿基構成的寡核苷酸，所述第二引物是由序列號4所示的堿基序列中的至少15個連續堿基構成的寡核苷酸。

2.根據權利要求1所述的存活蛋白mRNA的測定方法，其中，所述第一引物和第二引物為以下的任一種：

(i)所述第一引物是由序列號12或13所示的堿基序列中的至少15個連續堿基構成的寡核苷酸，所述第二引物是由序列號19～22所示的任一堿基序列中的至少15個連續堿基構成的寡核苷酸，

(ii)所述第一引物是由序列號14～18所示的任一堿基序列中的至少15個連續堿基構成的寡核苷酸，所述第二引物是由序列號20～25所示的任一堿基序列中的至少15個連續堿基構成的寡核苷酸。

3.根據權利要求1或2所述的存活蛋白mRNA的測定方法，其中，所述(6)的工序，即，測定RNA轉錄產物量的工序，是通過在熒光色素標記寡核苷酸探針共存下測定所述熒光特性的變化而進行的，所述熒光色素標記寡核苷酸探針設計成若形成與靶RNA互補的雙鏈則熒光特性發生變化。

4.根據權利要3所述的測定方法，其中，所述熒光色素標記寡核苷酸探針是介由連接子結合有插入性熒光色素的插入性熒光色素標記寡核苷酸探針。

5.根據權利要求4所述的測定方法，其中，所述插入性熒光色素標記寡核苷酸探針含有由序列號28～31所示的任一堿基序列中、或其互補序列中的至少15個連續堿基構成的寡核苷酸。

6.根據權利要求1～5中任一項所述的存活蛋白mRNA的測定方法，其中，在所述(1)的工序之前，即，以RNA為模板，利用具有RNA依賴性DNA聚合酶活性的酶合成與特定堿基序列互補的cDNA的工序之前，進行以下工序：以存活蛋白mRNA中的特定堿基序列為模板，利用(i)剪切用寡核苷酸和(ii)具有核糖核酸酶H(RNase?H)活性的酶，在所述特定堿基序列的5’末端部位剪切所述RNA；所述剪切用寡核苷酸具有對所述特定堿基序列中的、與第一引物的相同區域的5’末端部位重復的區域以及從該部位在5’側鄰接的區域互補的序列。

7.根據權利要求6所述的測定方法，其中，所述剪切用寡核苷酸是由序列號5～11所示的任一堿基序列構成的寡核苷酸。

8.一種寡核苷酸，其特征在于，是用于特異性地擴增或檢測存活蛋白mRNA的寡核苷酸，含有由序列號1～4或序列號28～31所示的任一堿基序列中或其互補序列中的至少15個連續堿基構成的寡核苷酸。

9.一種存活蛋白mRNA的測定試劑，其特征在于，至少含有1種權利要求8所述的寡核苷酸。