[發明專利]利用含有硼葡萄糖酸鈣絡合物的培養基生產胸膜炎肺炎放線桿菌毒素ApxI的方法

有效

• 申請號: 200980138625.1
• 申請日: 2009-11-25
• 公開（公告）號: CN102171361A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發明（設計）人: S-J·斯萊格曼;C·T·G·斯米茨;B·布盧特
• 申請（專利權）人: 英特威國際有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

本發明涉及一種通過在能夠支持細菌生長的液體培養基中培養胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacillus?pleuropneumoniae)生產RTX-毒素ApxI的方法，其中在所述培養基中加入鈣鹽以在培養基中生成鈣離子。

豬胸膜肺炎是豬的一種主要的呼吸系統疾病，已經蔓延到全世界范圍，由于高急性死亡、治療急性病豬和銷售慢性感染動物的延誤，給養豬業帶來嚴重的經濟損失。豬胸膜肺炎的病原體是胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacillus?pleuropneumoniae)。其主要通過動物間直接接觸傳播，這種感染在病程上有急性和慢性的不同。此疾病的病癥主要是呼吸道感染，臨床表現為高燒、嚴重的呼吸窘迫、咳嗽和厭食。此疾病發病很快，發病率和死亡率很高。控制胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacillus?pleuropneumoniae)(以下稱之為APP)感染的方法之一是疫苗接種程序。過去曾接種菌苗，但公知的是這種方法具有嚴重的副作用。現在通常使用的是基于APP病毒的亞單位疫苗。

APP產生的所謂RTX毒素(RTX指的是重復子毒素)。正是由于這些RTX-毒素的存在才在很大程度上導致了這種細菌的致病性。RTX-毒素過去被廣為綜述，文獻中也多有描述。眾所周知，并不是每種APP的血清型都能產生全部RTX-毒素，如1、5、9和11血清型產生ApxI和ApxII，2、3、4、6和8血清型產生ApxII和ApxIII，10血清型只產生ApxI，7和12血清型只產生ApxII。現在市場上用于抗APP的疫苗是基于ApxI、ApxII和ApxIII毒素的。新近發現所有的APP血清型都產生第四種RTX-毒素，現在這種毒素被稱之為ApxIV(參見EP?0?875574)。

如何在添加了鈣鹽(即基于酸的一種化合物，通過一個或多個鈣離子完全或部分替換酸中的氫離子形成)的培養基中，通過培養胸膜炎肺炎放線桿菌生成RTX-毒素ApxI已經很清楚了。特別是在專利EP0453?024中已經闡述了此種方法(見“Example?2”，第2段“溶血素的純化和鑒定”，子段落“Methods”)。需要注意，ApxI過去被稱之為溶血素(“HLY”)(Frey等，在J?Gen?Microbiol，1993年8月；139(8)：1723-8)。從這項EP專利可以知道，培養基中加入鈣化合物(CaCl2)。的確，在Microbiol?Pathogenesis?37(2004)29-33中已經提到，在生長培養基中加入鈣可以增強ApxI操縱子的轉錄活性。如此以來，可以獲得高含量的ApxI。培養基應支持APP細菌的生長。已經公知如何去構建支持細菌生長的培養基。傳統的培養基最初在上世紀五六十年代由Eagle、Ham等人研制，他們發現能夠滿足細菌基本生長需要的培養基應含有無機鹽、氮源(例如肽或蛋白質等含氮化合物)、碳源和維生素。培養基有利地被緩沖，以防止培養基酸性過強或者堿性過強。根據此基本配方，很多不同的組合方式都是可用的。例如，可以選擇動物來源成分提供氨基酸，也可以選擇化學限定的氨基酸。對于其他化合物，也可有多種不同的選擇。的確，構建能夠支持細菌生長基本要求的培養基相對來說比較簡單。然而，(構建能)優化生長和(或)代謝產物(的培養基)需要一定的研制時間，特別是當一種培養基首選的是不含血清或其它動物源成分時。在該技術領域內，提高發酵培養基性能的方法是公知的，并在文獻中有詳細的闡述(例如見Kennedy和Krouse在Journal?of?IndustrialMicrobiology?&?Biotechnology(1999)，23，456-475)中的綜述)。在發酵實驗室，這種優化(培養基)構成了常規實驗的一部分。培養APP時，因為APP是NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)依賴型的，所以從本質上說NAD屬于培養基的一部分。培養基中若不含NAD，則不能支持胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacillus?pleuropneumoniae)的生長，因此從本申請和所附權利要求意義上來說，也不能認為是支持APP生長的液體培養基。支持細菌生長的培養基，或者組成這些培養基的成分，可從很多公司如Sigma?Aldrich、Quest?International、Oxoid、Becton?Dickinson、Pharmacia、VGD?Inc、Mediatech，、Invitrogen，、Marcor、Irvin?Scientific等購得。