[發明專利]人兒茶酚-O-甲基轉移酶(COMT)測定有效

申請號：	200980138401.0	申請日：	2009-09-08
公開（公告）號：	CN102203119A	公開（公告）日：	2011-09-28
發明（設計）人：	何樹良;D·B·拉姆斯登;何永樂	申請（專利權）人：	香港大學
主分類號：	C07K7/08	分類號：	C07K7/08;C07K14/47;C07K16/18;C12N15/62;C12Q1/48;G01N33/536
代理公司：	中國專利代理(香港)有限公司 72001	代理人：	李進;郭文潔
地址：	中國香港***	國省代碼：	中國香港;81
權利要求書：	查看更多	說明書：	查看更多
摘要：
搜索關鍵詞：	人兒甲基轉移酶 comt 測定
鉆瓜網技術展會專利詞庫專利權人專利榜在售專利公布日期熱門專利

【說明書】：

發明背景

COMT為存在于人體許多組織中的酶。其主要功能為使起激素和神經遞質作用的腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺(兒茶酚胺)失活，從而促進從身體移除這些物質。本發明人以前已表明該酶的細胞水平由雌激素——雌二醇調節。許多化學物質(人造的和天然存在的)都可模擬或抑制雌二醇的作用。如果進入人體，這樣的化學物質可導致對雌二醇正常作用的干擾，并在人生命的各個階段都引起健康問題。這些化學物質以及影響其它激素作用和新陳代謝的其它化學物質統稱為內分泌干擾物。影響雌二醇作用的化學物質很可能是內分泌干擾物中最重要的一類。它們與西方男性的精子數下降以及常見癌癥例如乳腺癌和卵巢癌的成因有關。

本發明人已表明，多氯聯苯(PCB；公認對人類健康和較大范圍的環境具有極其嚴重的威脅)和各種增塑劑及相關化學物質能夠調節COMT蛋白表達水平。這些化學物質都不與雌二醇密切相關，但它們都通過與雌二醇相同的機理調節COMT水平(Ho等，2008a，b)。因而，測定暴露于這樣的化學物質的細胞中的COMT蛋白是對該化學物質雌激素活性的一種衡量。從未對存在于或者可能被引入環境中的大量化學物質評估過它們干擾內分泌的雌激素潛能。這是因為作為公認的內分泌干擾試驗的二代大鼠試驗很耗時間且非常昂貴。歐盟頒布的法規指出存在大約30,000種必須檢驗的化學物質。如上所述，COMT蛋白測定可能提供干擾雌激素內分泌潛能的衡量。測定COMT蛋白的現有方法慢、工作量大，且受限于樣品處理能力。例如，目前人COMT蛋白濃度的測定通過使用聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)/蛋白質印跡測定法實現。SDS-PAGE涉及使用包含丙烯酰胺和雙丙烯酰胺(它們為神經毒的)以及十二烷基硫酸鈉(它為肺刺激物和致敏物)的緩沖液和凝膠。盡管許多實驗室使用商用預制凝膠和制備好的緩沖液，以使工作人員暴露于這些化學物質的程度最小，但是它們存在于實驗室環境內，并且需要執行合適的安全規程以確保安全操作和處理。SDS-PAGE/蛋白質印跡法耗時、繁瑣、難以準確定量、相對受限于其處理樣品的能力，因而也是高成本的。

評估COMT濃度的備選方法為測定COMT活性并推斷結果。這涉及利用所述酶的放射性底物，以及伴隨它們的附帶危險和處理污染物的難題。因此，需要一種簡單、廉價并可處理很多樣品的COMT測定法。下文所述測定法克服了這些難題，因為其易于使用、廉價并具有高樣品處理能力。因此，其特別適合作為潛在雌激素內分泌干擾物的初始篩選系統。

發明簡述

本發明提供用于測定生物培養物、生物組織、生物液體和環境樣品中COMT蛋白水平的簡單、準確、廉價且快速的方法。

本發明的其它方面為新型抗體、多肽和多核苷酸。在另外的方面，本發明提供包含可用于測定的材料的試劑盒。

附圖簡述

圖1描述新型表位(NE)構建體的線性結構。

圖2闡述COMT測定的實施方案可如何進行。

圖3顯示COMT測定的實施方案如何運作。該測定中的顏色強度與標準樣品和未知濃度樣品中的COMT濃度成反比。

圖4提供新型表位(NE)的預測二級結構。

圖5顯示通過抗-NE抗體和抗-COMT抗體檢測HEK293細胞中的重組MB-COMT-NE蛋白。

圖6顯示通過抗-NE抗體和抗-COMT抗體免疫沉淀(IP)和檢測HEK293細胞中重組MB-COMT-NE蛋白的結果。

圖7顯示大腸桿菌中的重組MB-COMT-NE蛋白的考馬斯藍蛋白染色。

圖8顯示通過抗-NE抗體、抗-COMT抗體和抗-GST抗體檢測重組GST-MB-COMT-NE蛋白。