[發(fā)明專利]產(chǎn)生IPS細胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980138340.8
• 申請日: 2009-08-11
• 公開（公告）號: CN102171348A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: A·梅克
• 申請（專利權(quán)）人: 細胞動力國際有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/06
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進委員會專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 羅菊華

發(fā)明背景

本申請要求2008年8月12日提交的美國申請?zhí)?1/088,054的優(yōu)先權(quán)，該申請的全部內(nèi)容無所放棄地通過引用方式特別并入本文。

1.發(fā)明領(lǐng)域

本申請大體上涉及干細胞領(lǐng)域。更具體而言，本申請涉及體細胞的重編程(reprogramming)。

2.相關(guān)技術(shù)描述

一般而言，干細胞是未分化的細胞，其可以產(chǎn)生成熟的功能性細胞的演替。例如，造血干細胞可以產(chǎn)生任意的不同類型的末端分化的血液細胞。胚胎干(ES)細胞源自胚胎，其是多潛能的，因此具有發(fā)育成任意器官或組織類型，或至少潛在地發(fā)育成完整胚胎的能力。

誘導(dǎo)的多潛能干細胞(induced?pluripotent?stem?cell)，通常簡稱為iPS細胞或iPSC，是一類通過插入某些基因人工地從非多潛能細胞(通常為成年體細胞)衍生而來的多潛能干細胞。人們相信，在很多方面，誘導(dǎo)的多潛能干細胞與天然多潛能干細胞例如胚胎干細胞是相同的，例如在以下方面：某些干細胞基因和蛋白的表達、染色質(zhì)甲基化的式樣、加倍時間、胚狀體(embryoid?body)的形成、畸胎瘤的形成、活嵌合體的形成以及潛能和分化能力，但是其與天然多潛能干細胞的相關(guān)性的完整程度仍待確定。

IPS細胞首先于2006年從小鼠細胞中產(chǎn)生(Takahashi等人，2006)，于2007年從人類細胞中產(chǎn)生(Takahashi等人，2007；Yu等人，2007)。這在干細胞研究中被認(rèn)為是重要的進展，因為這可以允許研究人員獲得多潛能干細胞而不必爭議性地使用胚胎，多潛能干細胞在研究中具有重要意義并且具有潛在的治療性應(yīng)用。

但是，在這些誘導(dǎo)的多潛能干(iPS)細胞的研究的現(xiàn)階段，產(chǎn)生iPS細胞的效率低下，這阻礙了iPS細胞在臨床研究中的應(yīng)用。因此，需要開發(fā)一種增強產(chǎn)生誘導(dǎo)的多潛能干細胞的效率的方法。

發(fā)明概述

本發(fā)明通過以改善的效率提供誘導(dǎo)的多潛能干細胞而克服了本領(lǐng)域中的主要缺陷。在第一個實施方式中，提供了用于產(chǎn)生誘導(dǎo)的多潛能干(iPS)細胞群體的方法，所述方法包括以下步驟：(a)獲得一個或多個重編程載體，每個載體包含表達盒，所述表達盒包含：(i)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件；(ii)與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件可操作地連接的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列編碼重編程因子或報告分子；(iii)位于所述第一核苷酸序列的3’端的IRES；和(iv)編碼重編程因子或報告分子的第二核苷酸序列，其位于所述IRES的3’端，從而所述第二核苷酸序列受到所述IRES的翻譯控制，其中：(1)，如果所述第一核酸編碼重編程因子，則所述第二核苷酸序列編碼另一重編程因子或報告分子；和(2)如果所述第一核酸編碼報告分子，則所述第二核苷酸序列編碼重編程因子；(b)將所述重編程載體導(dǎo)入體細胞群體的細胞中；(c)培養(yǎng)所述細胞以擴展所述群體；(d)選擇所述經(jīng)擴展的群體的子代細胞，其中所述子代具有胚胎干細胞的一個或多個特征；和(e)培養(yǎng)所選擇的子代細胞以提供iPS細胞群體。

在一些方面，所述第一核苷酸序列編碼重編程因子并且所述第二核苷酸序列編碼報告分子，反之亦可，因此報告基因的同時表達輔助如下文描述的重編程細胞的選擇。

為了在同一轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件下共表達多個重編程因子，表達盒可以包含第二IRES和位于第二IRES的3’端的第三核苷酸序列，從而所述第三核苷酸序列受到所述第二IRES的翻譯控制。在一些實施方式中，所述第一和第二核苷酸序列可以編碼不同的重編程因子。在以上任意情況下，報告分子可由第一、第二或第三核苷酸序列編碼以改善轉(zhuǎn)染和iPS細胞選擇效率。

本發(fā)明的能力部分依賴于報告分子的表達，例如熒光蛋白，其作為感染效率的指示，一般與來自同一多順反子轉(zhuǎn)錄本的重編程基因的表達水平相關(guān)聯(lián)，一旦細胞被完全誘導(dǎo)為多潛能，則所述報告分子即沉默。例如，上述方法的步驟c)可以進一步包括選擇體細胞的群體，其中所述體細胞表達報告分子，并且培養(yǎng)所選細胞以擴展該群體。因此，在一些方面，可以使用熒光輔助的細胞分選法(FACs)基于報告分子例如熒光蛋白的表達水平來選擇被感染(從最低效率感染至最高效率感染)的細胞。