[發明專利]形成鑒別標記物的方法

有效

• 申請號: 200980135585.5
• 申請日: 2009-09-04
• 公開（公告）號: CN102159711A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: J·N·A·M·魯普范德伍爾特;A·P·索倫森
• 申請（專利權）人: 凱津公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

技術領域

本發明涉及一種形成生物體內分子標記物，特別是鑒別標記物的方法。該方法還涉及將一種選擇性標記物引入生物體的種質中，以及該標記物在例如植物育種過程中的用途。

背景技術

數十年來，DNA標記物技術正顯著地提高著植物育種的效率，其是通過基于容易的試驗標記物的選擇而非通常困難的表型性狀的選擇而實現的。然而，這樣的鑒別標記物的形成以及使用這些標記物的效率往往是費力并且費時的過程。首先，鑒別標記物的形成遵循由以下程序起始的過程

1)繪制目標性狀之下的基因的遺傳位置圖譜，

2)識別側翼標記物，

3)通過緊密連接的標記物的識別精細繪制基因圖譜，

4)確定最相關標記物的DNA標記物序列，

5)確定用于繪制目標基因圖譜的親代系之間標記物基因座上的序列變異，

6)形成簡單的PCR分析，

7)測定植物材料的遺傳背景(種質)中的預測值，其中測定鑒別標記物。

這里所用的種質是用于描述遺傳資源或者更確切地講生物體的DNA，以及這些材料的收集物的術語。育種者使用術語種質以表明它們的遺傳物質收集物，從種質中它們能夠產生變種。

幸運的是，近來的進展已經顯著加快了步驟1-4(Morgante和Salamini?2003?Curr.Opinion?in?Biotechnol?14：214-219；Varshney等，2005?TiPS?10：621-630)，特別是當處理單基因性狀時。步驟5-6依賴于序列變種(SNP)周圍獨特DNA標記序列片段(stretch)的存在，所述序列變種用于開發鑒別分析。植物基因組被重復序列完全地分散，所述重復序列嚴重妨礙了形成鑒別標記物分析的可能性。尤其是對于具有較大基因組尺寸的農作物，低拷貝DNA片段的識別就好比是大海撈針了。最后，步驟7非常依賴于1)農作物的繁育方式，和2)農作物基因組中的遺傳變異性水平。當發生功能性變異時，該變異會位于其他預成DNA多態性的單倍體上。由于性狀會通過隨機雜交的后代傳遞，因此會發生很多重組事件，所述重組事件將使得原始單倍體成為小連鎖障礙。這將引起性狀基因從大部分其原始單倍體的特定等位基因上分離。這樣的結果是只有具有與性狀基因極端緊密連結的DNA多態性或甚至性狀基因多態性自身可用于轉化成有用的DNA標記物。作為遠系雜交種隨機雜交種群的一個例子，重組和重組事件的高交換率產生了含有性狀的區域，該區域是(理論上講)非常小的。因此，與基因完美相關的DNA標記物是很難找到的。作為相反的一個例子，自交種種群中的連鎖障礙趨于相對較大，因為自交增加了純和性，從而限制了雜合體的數量，而雜合可以被重組所攪亂。然而，對于栽培種的遺傳基礎非常窄的農作物來講，鑒別任何作為DNA標記物形成的起始點的DNA多態性都是困難的，盡管存在有相對較大的連鎖障礙。

發明內容

本發明人旨在開發一種產生選擇性標記物的方法，所述方法避免了上述問題。

在本申請中，所述方法在目標區域引入了獨特的、人造的和選擇性的標記物，而不是鑒別和開發自然產生的序列變種。本方法的原理是，基于潛在標記物基因座上的序列知識，可以設計獨特的標記物，并且將它們引入含有目標性狀的種系中。優選的這些標記物的適用性是，連續幾代之后新引入的標記物與目標性狀始終如一地共分離。本發明人已經發現了一種以這種方式在目標區域中引入標記物的方法，該標記物作為具有廣泛預測價值的標記物是有用的。

本發明人發現一種基于鑒別和/或選擇DNA片段并且將該片段轉換成為選擇性分子標記物，進而克服以上困難的策略，所述DNA片段與目標性狀密切相關(即具有預定義的與目標特征共分離的一致性)，所述轉換使用定向突變、定向核苷酸交換(TNE)方法完成。特別地，本發明人發現了一種用于確定需要作出何種改變并且設計所需標記物的方法，以使任何遺傳變異性減少到最小，并且標記物的品質，即其相關性狀的預測值在種質內是最佳的，但是相比標記物最初由其形成的種質，其在不同的種質中也是有用的。

因此，本發明涉及一種用于在種質中引入一種或多種(獨特的并且選擇性的)分子標記物的方法，所述標記物與目標性狀緊密關聯，并且所述標記物位于基因組中的一個位置，該位置雖然與所希望的性狀緊密相關，但是不含有足夠的標記物信息。在該DNA片段中，使用TNE產生人造的并且獨特的多態性，其隨后可以用作選擇性的分子標記物。本發明還涉及TNE用于在生物體中產生獨特并且選擇性標記物的用途。

因此，在第一個方面，本發明涉及在生物體中形成鑒別標記物的方法，包括步驟：

-選擇目標性狀；