[發(fā)明專利]皮肌炎的診斷方法和診斷試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980134163.6
• 申請日: 2009-07-31
• 公開（公告）號: CN102138072A
• 公開（公告）日: 2011-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 桑名正隆;佐藤慎二;藤田尚志
• 申請（專利權(quán)）人: 學(xué)校法人慶應(yīng)義塾
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11204
• 代理人: 王達(dá)佐;洪欣

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及診斷皮肌炎的方法和試劑盒，以及用于診斷皮肌炎的抗原蛋白的用途。

背景技術(shù)

膠原病使其被視為自身免疫性疾病的基本特征是產(chǎn)生抗多種細(xì)胞組分的自身抗體。已知對應(yīng)這些自身抗體的許多抗原是生命過程中必不可少的酶和調(diào)節(jié)因子。預(yù)期研究自身抗體及其對應(yīng)抗原(自身抗原)的分子結(jié)構(gòu)以及它們的生物學(xué)功能有助于闡明結(jié)締組織病的病理。

多發(fā)性肌炎/皮肌炎(PM/DM)為炎性肌病，其中主要是骨骼肌炎癥所引起的近端肌無力和肌肉疼痛。特別是當(dāng)觀察到典型皮膚癥狀如向陽性皮疹和Gottron氏丘疹時，患者被診斷為DM。多發(fā)性肌炎/皮肌炎是一種自身免疫性疾病，并且已知產(chǎn)生了多種自身抗體。已經(jīng)報道了在PM/DM患者血清中存在抗體；這些抗體包括在肌炎患者中特別檢測到的抗氨酰tRNA合成酶抗體(抗ARS抗體)、抗SRP抗體、抗Mi-2抗體和類似抗體以及抗U1RNP抗體、抗SS-A抗體和與肌炎相關(guān)的類似自身抗體。已知的是，對于相同肌炎特異性自身抗體為陽性的患者表現(xiàn)出相似的臨床特征；這對于診斷、疾病類型分類、適當(dāng)治療方法的選擇和預(yù)后評估在臨床上是有用的。

相比之下，自身抗體陰性被認(rèn)為是PM/DM亞型臨床無肌病性DM(C-ADM)的特征之一。C-ADM特異性自身抗體的存在是未知的。已知C-ADM抵抗臨床治療，并且與不良預(yù)后的急進(jìn)性間質(zhì)性肺疾病(RP-ILD)有關(guān)。為了挽救患有RP-ILD的C-ADM患者的生命，已報道和推薦聯(lián)合利用高劑量類固醇療法和免疫抑制藥物給藥的早期有效治療的功效。因?yàn)檫@個原因，具有相關(guān)RP-ILD的C-ADM的早期診斷在臨床上是重要的，并且期望建立用于早期診斷的新指標(biāo)。

根據(jù)以上背景，本發(fā)明人根據(jù)免疫沉淀(IPP)法研究了正常健康對照、患有包括C-ADM在內(nèi)的結(jié)締組織病的患者以及患有特發(fā)性肺纖維化的患者的血清。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)C-ADM患者的血清中存在能夠識別一種140-kDa蛋白的新自身抗體，并且將該新自身抗體命名為“抗CADM-140抗體”(非專利文獻(xiàn)1(NPL?1))。

抗CADM-140抗體在患除C-ADM以外的結(jié)締組織病患者、特發(fā)性肺纖維化患者和正常健康對照中的任一組均未檢測到。臨床上觀察到抗CADM-140抗體陽性患者中RP-ILD顯著地頻繁發(fā)生，這表明抗CADM-140抗體與RP-ILD之間存在關(guān)聯(lián)(非專利文件2)。

該現(xiàn)象被認(rèn)為對于預(yù)后特別不良的具有相關(guān)RP-ILD的C-ADM的早期診斷和治療選擇是有用的，并因此希望改善其預(yù)后。

MDA5具有SNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi？locusId＝64135)。其氨基酸序列和堿基序列的NCBI登錄號為NM_022168。專利文獻(xiàn)1(PTL?1)公開了MDA5和癌癥之間的關(guān)系。

本發(fā)明人發(fā)表了非專利文獻(xiàn)3(NPL?3)，其公開了本發(fā)明所涉及的技術(shù)。

引文目錄

專利文獻(xiàn)

PTL?1：日本未經(jīng)審查的專利文件2003-531581號

非專利文獻(xiàn)

NPL?1：Arthritis?Rheum.46(9)：S398，2003

NPL?2：Arthritis?Rheum.52(5)：1571-1576，2005

NPL?3：Arthritis?Rheum.60(7)：2193-2200，2009

發(fā)明概述

技術(shù)問題

根據(jù)IPP方法，利用S³⁵標(biāo)記的白血病來源的K562細(xì)胞提取物或HeLa細(xì)胞對抗CADM-140抗體進(jìn)行了一般測量。雖然這是具有高靈敏度和高特異性的可靠測量方法，但是該方法使用同位素并需要復(fù)雜的程序。因此，該測量方法僅在數(shù)量有限的實(shí)驗(yàn)室中使用。

為了將抗CADM-140抗體的測量應(yīng)用到實(shí)際臨床診斷中，亟需建立能夠容易地測量大量樣品的測量系統(tǒng)。鑒定與抗CADM-140抗體相應(yīng)的抗原、制備重組蛋白及建立通過ELISA的測量系統(tǒng)等對于建立該系統(tǒng)是重要的。

問題的解決方案

本發(fā)明人利用HeLa細(xì)胞cDNA文庫克隆與抗CADM-140抗體相應(yīng)的抗原基因，并且研究了該相應(yīng)抗原蛋白的分子序列。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)MDA5(黑色素瘤分化相關(guān)基因5)為與抗CADM-140抗體相應(yīng)的抗原，并在這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成本發(fā)明。

本發(fā)明提供了用于皮肌炎診斷的試劑盒和方法，如下逐項(xiàng)所述。