[發明專利]降低了高表達基因來源的cDNA克隆含有率的cDNA文庫的制備方法

有效

• 申請號: 200980132279.6
• 申請日: 2009-08-25
• 公開（公告）號: CN102124106A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發明（設計）人: 大床國世;杉山雅英;加藤誠志
• 申請（專利權）人: 株式會社日立高新技術;國立殘疾人康復中心總長代表的日本政府
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C40B40/06
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘晶;陳彥

1.一種制備降低了目的基因來源的cDNA克隆含有率的cDNA文庫的方法，其特征在于，包括：

(i)：使雙鏈DNA引物與含有在5’端具有帽狀結構的mRNA的RNA混合物進行退火，進一步與至少一種結合到所述目的基因的mRNA上且抑制逆轉錄酶反應的探針進行退火的工序；

(ii)：通過逆轉錄酶由雙鏈DNA引物合成第一鏈cDNA，制作mRNA/cDNA異源雙鏈和雙鏈DNA引物的連接體的工序；和

(iii)：將mRNA/cDNA異源雙鏈和雙鏈DNA引物的連接體的含有cDNA的DNA鏈的3’端和5’端用連接酶進行連接，使其環狀化的工序。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，目的基因為高表達基因。

3.根據權利要求1所述的方法，其中，包括基于基因數據庫而選擇目的基因的工序。

4.根據權利要求1所述的方法，其中，具有帽狀結構的mRNA包含于細胞提取物中。

5.根據權利要求1所述的方法，其中，雙鏈DNA引物的引物序列包含與具有帽狀結構的mRNA的多聚(A)序列互補的序列。

6.根據權利要求1所述的方法，其中，連接酶為T4RNA連接酶。

7.根據權利要求1所述的方法，其中，在工序(ii)和工序(iii)之間包括以下工序：

(ii’)通過用限制性內切酶將mRNA/cDNA異源雙鏈和雙鏈DNA引物的連接體切斷，從而在雙鏈DNA引物的端部生成5’突出末端或平滑末端的工序。

8.根據權利要求1所述的方法，其中，在工序(iii)之后還包括以下工序：

(iv)將mRNA/cDNA異源雙鏈和雙鏈DNA引物的連接體的RNA鏈置換為DNA鏈的工序。

9.根據權利要求1所述的方法，其中，雙鏈DNA引物含有復制原點、或復制原點和cDNA表達用啟動子。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，結合到目的基因的mRNA上且抑制逆轉錄酶反應的探針為含有非天然型核酸、且比目的基因的部分序列的互補序列的熔解溫度(Tm值)高2℃以上的寡核苷酸。

11.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，結合到目的基因的mRNA上且抑制逆轉錄酶反應的探針為從5’端側起連續的2個以上堿基由非天然型核酸構成的寡核苷酸。

12.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，非天然型核酸為鎖核酸(Locked?Nucleic?Acid)、肽核酸(Polyamide?Nucleic?Acid)或交聯核酸(Bridged?Nucleic?Acid)。

13.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，結合到目的基因的mRNA上且抑制逆轉錄酶反應的探針分別以不同種類的目的基因的mRNA為對象。

14.一種探針，為具有與mRNA序列互補序列的探針，其由如下設計的寡核苷酸構成：該3’末端具有修飾成無法作為由逆轉錄酶而引起的延伸反應起始點的結構，且從5’末端起連續的2個以上堿基為非天然型核酸，且探針全體的堿基序列的Tm值比僅由天然型核酸構成的堿基序列的Tm值高2℃以上。

15.根據權利要求14所述的探針，其中，所述探針用于制備降低了目的基因來源的cDNA克隆含有率的cDNA文庫，結合到目的基因的mRNA上且抑制逆轉錄酶反應。

16.一種cDNA文庫制備試劑盒，其特征在于，含有權利要求14所述的探針、雙鏈DNA引物、逆轉錄酶、以及T4RNA連接酶。