[發明專利]用于生產高容量重組腺病毒的自失活輔助性腺病毒

無效

• 申請號: 200980128059.6
• 申請日: 2009-05-13
• 公開（公告）號: CN102099481A
• 公開（公告）日: 2011-06-15
• 發明（設計）人: 曼努埃拉·岡薩拉斯阿帕里西奧;魯本·埃爾南德斯阿爾科塞瓦;米倫伊莎索·毛萊翁馬約拉
• 申請（專利權）人: 西馬生物醫學計劃公司
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/85
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

1.一種多核苷酸，其包括：

a)編碼位點特異性重組酶的區域，其中所述區域由誘導型啟動子調控，以及

b)對于腺病毒基因組的復制和/或包裝必不可少的區域，其兩側為對由序列a)編碼的重組酶有特異性的識別序列，其中所述識別序列被定向，以使存在所述重組酶時，切除所述重要區域。

2.根據權利要求1所述的多核苷酸，其中用于包裝和復制腺病毒基因組的重要的區域b)是包裝信號Ψ。

3.根據權利要求1或2所述的多核苷酸，還包括編碼轉錄激活物的序列，所述轉錄激活物在存在所述轉錄激活物配體的情況下，能夠特異性激活調控由序列(a)編碼的重組酶表達的啟動子。

4.根據權利要求3所述的多核苷酸，其中所述轉錄激活物是四環素類似物依賴型反式作用因子。

5.根據權利要求4所述的多核苷酸，其中所述轉錄激活物是rtTA-M2反式作用因子。

6.根據前述任一項權利要求所述的多核苷酸，其中重組酶是Cre或者包括Cre重組酶序列的融合蛋白。

7.根據權利要求6所述的多核苷酸，其中重組酶還包括一激素結合域或一可激活的核定位序列，優選雌激素受體蛋白的激素結合域。

8.一種包括根據權利要求1到7任一項所述的多核苷酸的表達載體。

9.根據權利要求8所述的表達載體，其中所述載體是腺病毒載體。

10.一種包括據權利要求1到7任一項所述的多核苷酸序列的腺病毒顆粒。

11.一種用于自失活輔助性腺病毒復制和包裝的系統，其包括：

a)根據權利要求1到7中任一項所述的多核苷酸、或根據權利要求8到9中任一項所述的表達載體，或根據權利要求10所述的腺病毒顆粒；和

b)一真核細胞。

12.根據權利要求11所述的系統，其中細胞形成組分(b)包括一啟動子特異性轉錄阻遏物，其調控位點特異性重組酶的表達。

13.根據權利要求12所述的系統，其中所述特異性轉錄阻遏物在缺乏能夠促進位點特異性重組酶表達的配體時具有活性。

14.一種用于獲得自失活輔助性腺病毒的方法，其包括：

(i)在適合的條件下使細胞與根據權利要求1到7中任一項所述的多核苷酸、或根據權利要求8到9中任一項所述的表達載體，或根據權利要求10所述的腺病毒顆粒，和可選擇地與細胞中的一個或多個編碼對于細胞中腺病毒包裝或復制必要的腺病毒蛋白質的多核苷酸接觸，以使腺病毒基因組或包括所述基因組的多核苷酸進入細胞，

(ii)將該細胞維持在適當的條件下，允許細胞中腺病毒的包裝和復制，并阻止位點特異性重組酶的表達，和

(iii)從培養基中重新獲得腺病毒。

15.根據權利要求14所述的方法，其中所述細胞包括一調控位點特異性重組酶表達的啟動子特異性轉錄阻遏物，其中所述阻遏物在缺乏能夠促進位點特異性重組酶表達的配體的類似物時具有活性。

16.根據權利要求15所述的方法，其中所述阻遏物是強力霉素依賴型tTS阻遏物。

17.一根據權利要求16所述方法獲得的輔助性腺病毒。

18.根據權利要求1到7中任一項所述的多核苷酸、或根據權利要求8到9中任一項所述的表達載體，或根據權利要求10所述的腺病毒顆粒的應用，其包括用于生產和包裝高容量腺病毒的多核苷酸。

19.一種用于高容量重組腺病毒生產的系統，其包括：

(a)根據權利要求1到7中任一項所述的多核苷酸、或根據權利要求8到9中任一項所述的表達載體，或根據權利要求10所述的腺病毒顆粒；和

(b)一個腺病毒，其基因組包括目的基因，且該腺病毒缺少編碼至少一個復制所需的重要蛋白質的序列，或缺少編碼至少一個對所述腺病毒包裝重要的蛋白質的序列，或包含所述腺病毒基因組的多核苷酸，和

(c)一個真核細胞。

20.根據權利要求19所述的系統，其中真核細胞包括一多核苷酸，其表達由系統組分(a)編碼的位點特異性重組酶。