[發明專利]用于制造寡核苷酸的方法

有效

• 申請號: 200980123166.X
• 申請日: 2009-04-24
• 公開（公告）號: CN102076703A
• 公開（公告）日: 2011-05-25
• 發明（設計）人: 塔德烏什·克日什托夫·維爾奇凱維奇;哈根·克拉默;朱輝赫;凱文·詹姆斯·芬恩
• 申請（專利權）人: 集潤德斯股份公司
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 顧晉偉;韓宏星

本申請要求2008年4月24日提交的U.S.申請號60/047524的權益，其全部內容通過引用結合在此。

本發明涉及一種用于制造寡核苷酸的方法。寡核苷酸及其衍生物是例如用于癌癥治療的有用的候選藥物。

在寡核苷酸的合成過程中，特別是通過亞磷酰胺方法時，β-氰乙基保護基常見的是用作磷的保護基。將這些氰乙基團進行脫保護是為了到達最終產物的一個步驟。

US專利6,858,715和7,199,236(其全部內容通過引用結合在本說明書中)描述了一種將β-氰乙基保護基進行脫保護的方法，其中必須使用一種胺，該胺的共軛酸具有一個從約8到約11的pKa?。

Eritja?et?al.Helv.Chim.Acta，Vol?83(2000)p.1417-1423披露了使用DBU在乙腈中的0.5M濃溶液將用β-氰乙基保護的寡核苷酸進行脫保護的方法。

現在已經出人意料地發現，即便是其共軛酸具有大于11.5(例如約12)的pKa的強堿，也可以在特定條件下引起對(例如)β-氰乙基保護基的實質上完全的脫保護，而同時基本上避免氰乙基到核堿基(特別是胸苷)的多種加合物的形成。

本發明因此涉及一種制造寡核苷酸的方法，該方法包括至少一個步驟，該步驟是去除β-消除的保護磷的基團，特別是來自一種受保護的寡核苷酸的β-氰乙基保護基，其中所述去除包括使該受保護的寡核苷酸與一種胺溶液在一種溶劑中進行接觸，該溶劑優選不包含吡啶，其中該胺的共軛酸具有一個大于11.5的pKa，并且其中該胺在該溶液中的濃度是小于0.5摩爾/升。

已經出人意料地發現，根據本發明的方法允許以高的選擇性和產率對磷受保護的多種寡核苷酸(特別是對β-氰乙基保護基)進行特別有效的脫保護。在脫保護的過程中所不希望的副反應可以基本上避免。

該胺在溶液中的濃度是高于0摩爾/升。它優選等于或高于0.03摩爾/升。胺在溶液中的濃度經常是低于或等于0.4，優選低于或等于0.3摩爾/升，更優選低于或等于0.25摩爾/升。這種優選的濃度可以為，例如，低于或等于0.15摩爾/升，或者低于或等于0.1摩爾/升。約0.05摩爾/升的一種胺濃度給出了良好的結果。

與該受保護的寡核苷酸相接觸的胺的總量可以變化。在一個實施方案中，該量是使該胺與這些有待被去除的保護基(特別是β-氰乙基保護基)之間的摩爾比為等于或大于1。

在另一個實施方案中，與該受保護的寡核苷酸相接觸的胺的總量是使該胺與這些有待被去除的保護基(特別是β-氰乙基保護基)之間的摩爾比為等于或大于0.01并且等于或小于0.9，優選約0.1。

術語“寡核苷酸”在本發明的框架中具體是指多個核苷單體單元(包括多個連接到核堿基上的糖單元)的一種寡聚物，所述核苷單體單元通過多個核苷酸間鍵相連接。一個“核苷酸間鍵”具體是指兩個核苷部分之間的一個化學連接，例如典型地在天然發現的核酸中存在的磷酸二酯連接，或者典型地在多種合成核酸以及核酸類似物中存在的其他連接。這種核苷酸間鍵可以，例如，包括一個磷酸(phospho)或亞磷酸酯基團，并且可能包括一些連接，在這些連接中磷酸或亞磷酸基團的一個或多個氧原子或被一個取代基修飾、或被其他原子取代，例如硫原子或者單或二烷基氨基中的氮原子。典型的核苷酸間鍵是磷酸的二酯類或其衍生物，例如磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硫代磷酰胺酯。

術語“核苷”應理解為具體是指由一個核堿基連接到一個糖上所構成的一種化合物。糖類包括但不限于呋喃糖環，如核糖、2’-脫氧核糖，以及非呋喃糖環，如環己烯基、脫水己糖醇、嗎啉基。在核苷中所包括的糖中，在下文中指出的修飾、取代以及位置是參考呋喃糖而討論的，但是相同的修飾和位置也適用于其他糖環的類似的位置。該糖可以被進一步修飾。作為糖的修飾的非限制性例子，值得注意地可以提及例如在2’-或3’-位置的修飾，特別是在一個呋喃糖環的2’-位置的修飾，包括例如氫；羥基；烷氧基，如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、甲氧乙基、烷氧基、苯氧基；疊氮基；氨基；烷氨基；氟、氯和溴；2’-4’-和3’-4’-連接的呋喃糖環修飾，在該呋喃糖環中的修飾包括例如針對環的4’-O被S、CH₂、NR、CHF或CF₂取代。