[發明專利]具有改進的D-木糖利用能力的棒狀桿菌轉化體

有效

• 申請號: 200980123139.2
• 申請日: 2009-06-10
• 公開（公告）號: CN102066553A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發明（設計）人: 湯川英明;乾將行
• 申請（專利權）人: 財團法人地球環境產業技術研究機構
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/04;C12N15/09;C12P7/06;C12P7/18;C12P7/46;C12P7/54;C12P7/56
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 張穎;樊衛民

技術領域

本發明涉及D-木糖利用技術。更詳細來說，本發明涉及通過針對改進的D-木糖利用能力進行遺傳修飾產生的棒狀桿菌轉化體，并涉及使用所述轉化體的有效的有機化合物生產技術。

背景技術

纖維素生物質用作原材料通過生物方法生產多種有機酸化合物、乙醇等。纖維素生物質的實用性可歸因于其可利用性。與糖基生物質例如玉米淀粉和糖不同，纖維素生物質容易以各種不同形式例如農業廢棄物或木材廢棄物的形式低成本獲得，并因此不被認為將對確保食物資源構成障礙。纖維素生物質包含約35到45質量％的纖維素、約30到40質量％的半纖維素、約10質量％的木質素和約10質量％的其他成分。纖維素是葡萄糖(一種己糖)的聚合物。同時，半纖維素主要由戊糖例如木糖和阿拉伯糖構成。

纖維素生物質例如玉米秸稈、麥桿、稻稈和甘蔗渣的半纖維素，主要由D-木糖構成。因此，為了有效利用纖維素生物質，迫切需要建立起通過生物方法有效利用D-木糖的技術。

在纖維素生物質利用技術中，需要首先將原材料糖化成單糖例如己糖和戊糖，并且出于工藝設計的原因，這些單糖共存于培養基中用于生產有機化合物。通常在這種情況下，發生戊糖被己糖的所謂“葡萄糖阻遏(glucose?repression)”。葡萄糖阻遏使得不能平行和同時地利用己糖和戊糖，是一種使工藝設計和操作控制復雜化的因素，并阻礙了生物質的工業化和有效利用技術的建立。在這方面的改進也是需要的。

眾所周知，許多微生物利用葡萄糖——一種己糖，通過發酵來生產多種有機化合物，也已知道，某些微生物利用D-木糖——一種戊糖來生產乙醇等。

專利文獻1和非專利文獻1公開了一種技術，其中通過經質粒導入三個基因、即來自于樹干畢赤酵母(Pichia?stipitis)的木糖還原酶基因和木糖醇脫氫酶基因以及來自釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)的木酮糖激酶基因，為不能利用D-木糖的野生型釀酒酵母提供了D-木糖利用能力；并公開了使用所獲得的釀酒酵母轉化體的D-木糖利用技術[0]。但是釀酒酵母轉化體不具有足夠的D-木糖利用速率，并且在存在D-葡萄糖和D-木糖二者的情況下，觀察到了D-木糖利用中的葡萄糖阻遏(在存在D-葡萄糖的情況下，D-木糖利用速率極大減慢)。換句話說，還沒有建立有效的D-木糖利用技術。因此，需要在這些方面進行改進。

非專利文獻2也涉及包含釀酒酵母的技術，公開了一種用于分離具有改進的D-木糖攝取和同化速率的變體的技術，通過產生具有被破壞的醛糖還原酶基因并高度表達來自釀酒酵母的木酮糖激酶基因、核酮糖5-磷酸異構酶基因、核酮糖5-磷酸差向異構酶基因、轉酮酶基因和轉醛酶基因以及來自真菌Piromyces?sp.的木糖異構酶基因的釀酒酵母轉化體獲得了變體，然后在厭氧限木糖恒化器中并隨后在厭氧自動順序分批反應器中進行培養，并公開了使用所獲得的菌株的D-木糖利用技術。在該技術中，與上述專利文獻1和非專利文獻1的技術中相比，D-木糖利用速率增加，但仍然不夠。此外，在存在D-葡萄糖和D-木糖二者的情況下，仍然觀察到了D-木糖利用中的葡萄糖阻遏。因此，需要在這些方面進行改進。

專利文獻2公開了D-木糖利用技術，其中利用了通過將四個基因、即來自大腸桿菌的木糖異構酶基因、木酮糖激酶基因、轉酮酶基因和轉醛酶基因經質粒導入不能利用D-木糖的野生型運動發酵單胞菌(Zymomonas?mobilis)中并使基因表達所獲得的運動發酵單胞菌轉化體。

專利文獻3公開了D-木糖利用技術，其中利用了通過將四個基因、即來自大腸桿菌的木糖異構酶基因、木酮糖激酶基因、轉酮酶基因和轉醛酶基因整合到野生型運動發酵單胞菌的染色體中并使基因表達所類似獲得的運動發酵單胞菌轉化體，轉化體中的四個基因更加穩定。在這些已知技術中，在一定程度上實現了己糖和戊糖的同時利用，但是D-木糖的消耗速率(利用速率)與D-葡萄糖的消耗速率(利用速率)相比不足，因此需要進一步改進以建立同時利用己糖和戊糖的實用技術。

盡管野生型大腸桿菌菌株能夠例如戊糖包括D-木糖，但已知在D-葡萄糖和D-木糖同時存在的情況下，上面提到的葡萄糖阻遏影響了D-木糖利用。非專利文獻3和非專利文獻4報道了通過破壞負責葡萄糖攝入的ptsG(葡萄糖磷酸轉移酶系統(PTS)轉運蛋白)基因，可以獲得能夠同時利用D-葡萄糖和D-木糖的微生物。但是，大腸桿菌具有對工藝操作條件的變化敏感而產生溶解的問題。此外，大腸桿菌的乙醇耐受性比釀酒酵母和運動發酵單胞菌的乙醇耐受性低。因此，利用大腸桿菌生產乙醇具有乙醇終濃度低的問題(從發酵液濃縮和純化乙醇需要大量能量)。