[發(fā)明專利]樣品中感興趣結(jié)構(gòu)的高空間分辨率成像

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980118266.3
• 申請日: 2009-05-20
• 公開（公告）號: CN102037347A
• 公開（公告）日: 2011-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: J·弗林;C·埃格林;A·艾格納;A·舍恩勒;M·博西;S·黑爾
• 申請（專利權(quán)）人: 馬克思-普朗克科學(xué)促進(jìn)協(xié)會
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司 72002
• 代理人: 陳松濤;韓宏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于樣品中感興趣結(jié)構(gòu)的高空間分辨率成像的方法，所述方法包括權(quán)利要求1的前序部分的特征。

背景技術(shù)

WO?2006/127692?A2公開一種用于樣品中感興趣結(jié)構(gòu)的高空間分辨率成像的方法，其中使用以所謂的可光學(xué)變換(phototransformable)的光學(xué)標(biāo)記為形式的可切換熒光染料對感興趣結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記。將標(biāo)記的子組(subgroup)分別激活為該標(biāo)記的子組能夠被激發(fā)以發(fā)射熒光的狀態(tài)。各自的子組包括如此少的標(biāo)記以使得這些標(biāo)記位于到彼此的距離大于用于將樣品成像到傳感器陣列上的空間分辨率極限的位置。這使得在將子組的標(biāo)記激發(fā)為發(fā)熒光之后，能夠以比應(yīng)用于將樣品成像到傳感器陣列上的空間分辨率的衍射極限更好的分辨率定位(localize)熒光的初始位置，從而也以該提高的分辨率分別記錄被標(biāo)記的感興趣結(jié)構(gòu)的點(diǎn)。在WO?2006/127692中限定了可光學(xué)變換的光學(xué)標(biāo)記，其中這些光學(xué)標(biāo)記能夠由激活信號開啟到這些光學(xué)標(biāo)記可以被激發(fā)以發(fā)射熒光的狀態(tài)。該激活信號可以與隨后將標(biāo)記激發(fā)為熒光的激發(fā)光相同。在WO?2006/127692中公開的可光學(xué)轉(zhuǎn)換的光學(xué)標(biāo)記的更加具體的實(shí)施例僅僅包括可光學(xué)激活的熒光蛋白質(zhì)，即只有在已經(jīng)吸收了至少一個光量子之后才變?yōu)闊晒鈭F(tuán)的分子，或者換句話說，這些分子在成為熒光之前需要被初始開啟。激活或者切換過程需要改變分子的分子結(jié)構(gòu)(原子團(tuán)的重新定位或者甚至鍵的斷開或者形成鍵合)。WO?2006/127692公開的方法也被稱為PALM(光學(xué)激活的定位顯微術(shù))。

被稱為STORM(隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù))并且由Rust等人在Nature?Methods，3，793-796(2006)中描述的類似方法同樣使用可切換為熒光狀態(tài)的分子，即可切換的熒光染料，盡管這些不是蛋白質(zhì)而是可光學(xué)切換的有機(jī)熒光團(tuán)，尤其是熒光染料Cy3和Cy5。已知這些青色素(cyanine)染料能夠在不同的構(gòu)象(conformational)狀態(tài)，特別是同質(zhì)異構(gòu)狀態(tài)，之間切換。

PALM和Storm方法的缺陷在于，不能夠預(yù)測樣品中感興趣結(jié)構(gòu)將何時被記錄到這樣完全的程度而使得確定進(jìn)一步分子的位置將不會提供任何附加的有用信息并且因此終止了該方法。

在C.Geisler，A.C.von?Middendorff，H.Bock，C.Eggeling，A.Enger和S.W.Hell在Appl.Phys.A?88，223-226(2007)中發(fā)表的標(biāo)題為“Resolution?ofλ/10in?fluorescence?microscopy?using?fast?single?molecule?photo-switching”的文章中描述了一種用于樣品中感興趣結(jié)構(gòu)的高空間分辨率成像的方法，該方法包括權(quán)利要求1的前序部分的特征，并且被稱為PALMIRA(具有獨(dú)立運(yùn)行的采集的PALM)。這里，使用可切換的熒光蛋白質(zhì)標(biāo)記樣品中感興趣結(jié)構(gòu)。具體地說，是名稱為rsFastLime的蛋白質(zhì)，通過波長為488nm的光，不僅在其初始狀態(tài)下被激發(fā)為發(fā)熒光而且還被部分地關(guān)閉為非熒光狀態(tài)并且自此再次被局部切換回到其熒光狀態(tài)。內(nèi)在機(jī)制是熒光團(tuán)的構(gòu)象改變。利用僅具有單一波長的光，可切換的熒光蛋白質(zhì)的這些特性使得能夠交替地建立蛋白質(zhì)的可發(fā)熒光的分子的子組，在該子組中，可發(fā)熒光的分子位于比衍射極限大的共同間隔處，并且將可發(fā)熒光的分子激發(fā)為發(fā)熒光。從而能夠連續(xù)，即以高頻率，記錄圖像，該圖像注冊(register)熒光分子的交替子組，并且能夠以超出衍射極限的精度確定圖像中各自注冊的分子的位置。利用圖像的求和，以比衍射極限精細(xì)的空間分辨率記錄樣品中的結(jié)構(gòu)。

由上面解釋的方法使用的可切換熒光蛋白質(zhì)已經(jīng)在US?2004/0212799A1和US?2006/0038993?A1中描述的用于樣品中感興趣結(jié)構(gòu)的高空間分辨率成像的方法(被稱為RESOLFT(可逆可飽和的光學(xué)熒光轉(zhuǎn)換))中首次使用。