[發(fā)明專利]微生物檢測(cè)和計(jì)數(shù)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200980112246.5
• 申請(qǐng)日: 2009-03-20
• 公開（公告）號(hào): CN101998999A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: Y·弗維;A·杜克雷;S·迪康
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 巴斯夫歐洲公司;科學(xué)研究國家中心
• 主分類號(hào): C12Q1/06
• 分類號(hào): C12Q1/06;G01N33/50
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所 11247
• 代理人: 黃革生;林柏楠

本發(fā)明涉及檢測(cè)和計(jì)數(shù)樣品中物種嗜肺軍團(tuán)桿菌(Legionellapneumophila)存活微生物的方法。本發(fā)明也包括適用于此方法的試劑盒。此方法和試劑盒使存活微生物的定量更快速。

軍團(tuán)桿菌(Legionella)細(xì)菌在潮濕或濕潤環(huán)境例如土壤和非海水生生境中普遍存在。也可以在溫水和冷水設(shè)施、空調(diào)系統(tǒng)的冷卻塔和加濕器中找到它們。

軍團(tuán)桿菌特別是嗜肺軍團(tuán)桿菌是病原體，可引起急性細(xì)菌性肺炎，通常稱為“軍團(tuán)病”，在感染的個(gè)體中經(jīng)常是致命的。

嗜肺軍團(tuán)桿菌的傳統(tǒng)檢測(cè)和計(jì)數(shù)是通過細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行。此方法可使用平板計(jì)數(shù)通過測(cè)量可培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行，或應(yīng)用濾過膜方法測(cè)量微菌落進(jìn)行。這些技術(shù)通過存活細(xì)菌形成菌落或微菌落的能力評(píng)估存活細(xì)菌。不幸的是，這些方法通常需要3至10天以形成菌落或微菌落。當(dāng)用水裝置仍然在運(yùn)行時(shí)，在這期間存在感染人的不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。

檢測(cè)總軍團(tuán)桿菌微生物的其他方法包括PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)。PCR應(yīng)用DNA聚合酶通過體外酶促復(fù)制擴(kuò)增一段DNA。在技術(shù)進(jìn)行中，生成的DNA作為復(fù)制的模板使用從而導(dǎo)致DNA模板指數(shù)擴(kuò)增的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。PCR通過生成百萬或更多拷貝的DNA段使單個(gè)或較少拷貝的一段DNA擴(kuò)增。一般的這些方法在Diederen等人，J?Med?Microbiol.2007?Jan；56(Pt1)：94-101中描述。

然而PCR的一個(gè)缺點(diǎn)是樣品容易包含聚合反應(yīng)抑制劑，因此不能一致的提供量化結(jié)果。此外，該技術(shù)依賴于之前的DNA純化步驟，所述步驟可導(dǎo)致DNA的損失從而導(dǎo)致低估存在的軍團(tuán)桿菌。在一定程度上定量實(shí)時(shí)PCR克服了這些缺點(diǎn)。然而，該技術(shù)不能區(qū)分存活細(xì)胞和非存活細(xì)胞。

另一個(gè)技術(shù)是熒光原位雜交(FISH)，其中熒光物質(zhì)標(biāo)記的寡核苷酸探針滲入細(xì)菌細(xì)胞。其中核糖體核酸(rRNA)具有針對(duì)探針的正確序列即靶標(biāo)，探針將與其靶標(biāo)吸附，并且在任意后續(xù)清洗步驟中不被去除。固定了探針的細(xì)菌之后將發(fā)射熒光信號(hào)。此熒光信號(hào)可通過例如流式細(xì)胞術(shù)、固相細(xì)胞術(shù)或表面熒光顯微鏡技術(shù)(epifluorescent?microscopy)定量。一般的FISH技術(shù)在Dutil?S?et?al?J?Appl?Microbiol.2006May；100(5)：955-63中描述。然而，單獨(dú)使用FISH技術(shù)可檢測(cè)存活的嗜肺軍團(tuán)桿菌總數(shù)，但不幸的是該方法無法專門鑒定能夠分裂并從而形成菌落的嗜肺軍團(tuán)桿菌細(xì)菌。

計(jì)數(shù)存活嗜肺軍團(tuán)桿菌的另一個(gè)方法涉及ChemChrome?V6，在Delgado-Viscogliosi等，Appl?Environ?Microbiol.2005Jul；71(7)：4086-96中描述。此方法允許量化嗜肺軍團(tuán)桿菌，并能夠區(qū)分存活和非存活細(xì)菌。此方法結(jié)合了用抗體和細(xì)菌存活標(biāo)記(ChemChrome?V6)特異性檢測(cè)軍團(tuán)桿菌細(xì)胞和應(yīng)用表面熒光顯微鏡術(shù)計(jì)數(shù)。然而，盡管此技術(shù)可區(qū)分存活和非存活細(xì)胞，但不能單獨(dú)鑒定那些形成菌落的細(xì)菌。

US?20070218522描述了檢測(cè)和定量存活軍團(tuán)桿菌和其他異養(yǎng)需氧細(xì)菌的方法和組合物，所述方法包括使用包括吸收性培養(yǎng)基、生長促進(jìn)和生長選擇性物質(zhì)的蘸片快速檢測(cè)和定量軍團(tuán)桿菌微菌落。此技術(shù)不能計(jì)數(shù)損傷的細(xì)菌。

EP?1329515涉及檢測(cè)包含過氧化氫的氣態(tài)環(huán)境中微生物存在的方法，通過將氣態(tài)環(huán)境與包含丙酮酸鹽的瓊脂生長培養(yǎng)基接觸，允許微生物菌落的發(fā)展。

一般認(rèn)為涉及在生長培養(yǎng)基例如營養(yǎng)瓊脂板上生長菌落的技術(shù)更準(zhǔn)確。因此平板計(jì)數(shù)方法仍然是獲得總活菌數(shù)的優(yōu)選方法。這一般表示將疑為包含微生物的樣品應(yīng)用于包含固體營養(yǎng)來源或生長培養(yǎng)基的平板上。這一技術(shù)一般稱為平板接種。提及總活菌數(shù)，我們的意思是能夠產(chǎn)生觀察者可識(shí)別群體的細(xì)菌總數(shù)。一般的這表示在生長培養(yǎng)基例如營養(yǎng)瓊脂板表面的可見菌落。

然而，環(huán)境中的微生物例如嗜肺軍團(tuán)桿菌可能經(jīng)受一種或多種阻礙微生物在其環(huán)境條件下生長和繁殖的脅迫。這些受脅迫的微生物在常規(guī)培養(yǎng)條件下完全不會(huì)分裂或不形成可見菌落。在環(huán)境中一部分微生物細(xì)胞一般會(huì)承受由于環(huán)境條件例如饑餓、殺生物劑的存在、熱休克和干燥的壓力。此外，這些細(xì)胞可能處于脆弱的生理狀態(tài)，平板接種微生物技術(shù)可能加重已經(jīng)受脅迫的微生物的脅迫，原因是大氣中氧氣的存在。此外這可能導(dǎo)致受脅迫細(xì)菌的人為死亡，從而導(dǎo)致總活菌數(shù)的低估。

此外，由于其致病性，平板接種方法導(dǎo)致的存活嗜肺軍團(tuán)桿菌的低估可能是危險(xiǎn)的。