[發(fā)明專利]可高選擇性且高效率地進行PCR擴增的新型DNA

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980111666.1
• 申請日: 2009-03-31
• 公開（公告）號: CN101981186A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發(fā)明（設計）人: 平尾一郎;平尾路子;橫山茂之
• 申請（專利權(quán)）人: 塔古西庫斯生物株式會社
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;A61K31/7115;C07H21/04;C12Q1/68
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張平元

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及可高選擇性、高效率復制的人工堿基對以及包含該人工堿基對的核酸的復制方法。此外，本發(fā)明還涉及通過核酸的復制反應將結(jié)合有功能性取代基的人工堿基導入DNA中的方法。本發(fā)明還涉及從核酸庫中復制并選擇性地回收包含人工堿基對的核酸的方法。本發(fā)明還涉及用于實現(xiàn)包含人工堿基的核酸的高效率且高選擇性復制的、測定DNA中的人工堿基附近的天然型堿基的序列的方法。

背景技術(shù)

核酸通過A-T(U)和G-C堿基對的自身互補性進行擴增，并且作為催化劑和配體發(fā)揮功能。然而，與天然型蛋白質(zhì)中的20種不同氨基酸相比，天然型核酸是僅由4種不同的堿基所構(gòu)成的核苷酸來形成的，這種數(shù)量上的限制制約了DNA和RNA分子的功能。非天然型堿基對系統(tǒng)可以增加核酸堿基的種類、擴展遺傳信息，因而是上述問題的解決之道(非專利文獻1-5)。作為非天然型堿基對，要求其具有高特異互補性，可以通過聚合酶催化反應在DNA和RNA中特殊的核苷酸類似物的部位特異性地導入。這如能實現(xiàn)，則受天然存在堿基的數(shù)量制約的當前的基因工程將被使用非天然型堿基對系統(tǒng)的新技術(shù)替代。

Benner等進行了構(gòu)建非天然型堿基對的最初嘗試(非專利文獻6-7)。他們采用不同于天然型堿基對的氫鍵模式開發(fā)出數(shù)種非天然型堿基對，諸如異鳥嘌呤-異胞嘧啶(isoG-isoC)和黃苷-二氨基嘧啶(キサントシン-ジアミノピリミジン)等。最近，這些非天然型堿基對被應用于含有該堿基對的DNA片段的PCR擴增(非專利文獻8-9)和序列分析(非專利文獻10)。然而，其保真度不高和/或需要麻煩的方法。

接著，Kool等合成了具有與天然型堿基相類似的形狀，但在堿基配對中缺乏形成氫鍵的能力的疏水性堿基(非專利文獻11-12)。這些疏水性堿基可以被DNA聚合酶選擇性地識別，因而這提示：在復制中，堿基對間的幾何學的形狀的互補性比氫鍵相互作用更為重要。最近，Romesberg等開發(fā)了一系列疏水性堿基對，而且利用大腸桿菌來源的DNA聚合酶I的克列諾片段(Klenow?fragment)將這些堿基對互補地導入到了DNA中(非專利文獻13-15)。然而，在復制中，疏水堿基出現(xiàn)了不遵從形狀互補性，在疏水性堿基間非特性的導入(非專利文獻14)。

通過組合氫鍵模式與形狀互補性的概念，本發(fā)明人等開發(fā)出如下非天然型堿基對：2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤(s)與2-氧代吡啶(オキソピリジンoxypyridine)(y)(專利文獻1，非專利文獻16-17)、以及2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤(v)與y(專利文獻2，非專利文獻18)。s和v的6位的大取代基有效地抑制其與天然型堿基形成不希望的堿基對(non-cognate?pairing)，而且，通過T7RNA聚合酶能夠?qū)和修飾y堿基的底物(核苷5’-3磷酸)部位特異性地導入到RNA中，來與模板中的s或v互補。這種特異性轉(zhuǎn)錄可以作為開發(fā)功能性RNA分子的方法而實用化(非專利文獻19-21)，但復制中s-y和v-y堿基對的選擇性不如轉(zhuǎn)錄中的選擇性那么高(非專利文獻16、18)。

已經(jīng)報導的在復制方面接近實用化水平的人工堿基對包括美國S.A.Benner等的P-Z堿基對(P：2-氨基-咪唑并[1，2-a]-1，3，5-三嗪-4(8H)-酮；和Z：6-氨基-5-硝基-2(1H)-吡咯烷酮)(非專利文獻22)、美國EraGen公司的isoG-isoC堿基對(專利文獻3和非專利文獻9)、以及同時是本發(fā)明人的平尾等的Ds-Pa堿基對與Ds-Pn堿基對(Ds代表5-氨基-7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基、Pa代表2-甲酰基-1H-吡咯-1-基、Pn代表2-硝基-1H-吡咯-1-基)(專利文獻4以及非專利文獻23和24)。但是，Benner等人和EraGen公司的人工堿基對在復制中的選擇性低，PCR循環(huán)數(shù)受到限制，難以檢測微量DNA。此外，平尾等人的人工堿基對的選擇性雖高，但其復制必須使用特殊的底物，PCR擴增效率也不那么高。