[發(fā)明專利]測定和表征人體液中微泡的新方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980111452.4
• 申請日: 2009-01-26
• 公開（公告）號: CN102317778A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: S·法伊斯;M·洛戈齊
• 申請（專利權(quán)）人: 漢薩生物醫(yī)藥公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/574;G01N33/569
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 趙向輝;郭文潔

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明大體上涉及癌癥診斷領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及定量和定性人體液中外來體(exosomes)的方法。

背景技術(shù)

外來體是大小介于30-120nm之間的微泡，其通過通常用于受體釋放和細胞間相互通信的胞吐途徑活躍地分泌。在多步超速離心后，可以在細胞培養(yǎng)上清液和一些體液中檢測到外來體。除了主要組織相容性復合體蛋白(MHC?I、MHC?II)以及參與抗原呈遞的蛋白之外，外來體可能攜帶參與多種細胞功能的膜蛋白和胞質(zhì)蛋白。在特定生理條件下，從不同細胞類型分泌外來體，所述細胞類型如樹突狀細胞(DC)、淋巴細胞、肥大細胞和上皮細胞。該過程導致形成了籃樣細胞貯器，其含有也稱為多泡體(MVB)的這些多融合源微泡。已通過超結(jié)構(gòu)觀察分辨了該過程，特別是在正常細胞中。但是，通過外來體制備物的免疫電子顯微鏡和蛋白質(zhì)印跡分析已表明這些微泡共表達了不同胞內(nèi)液泡的標志物，如早期內(nèi)涵體(例如，Rab5)、溶酶體(例如CD63、CD81、LAMP-1)和晚期吞噬體(Rab7)，以及其它一些細胞特異性更強的蛋白(例如MHC?III類抗原)。

從腫瘤細胞釋放的外來體明顯多于從正常細胞釋放的外來體，并且它通常與免疫抑制作用有關(guān)。除了一些腫瘤標記物(如，結(jié)腸癌的CEA、黑素瘤的MART-1或gp-100)的表達外，腫瘤來源的外來體在多個方面與正常細胞的外來體可比較。此外，似乎腫瘤外來體的來源在多個方面是與正常外來體不相似的。這可能是由于惡性細胞從細胞質(zhì)到胞外環(huán)境的囊泡運輸更有活力所造成的，反之亦然。

腫瘤外來體在癌癥發(fā)展中的作用是最近出現(xiàn)的研究領(lǐng)域。初始數(shù)據(jù)表明這些細胞器起到DC介導的T細胞交叉激活的腫瘤抗原性材料載體的作用。這些結(jié)果支持了使用腫瘤外來體作為抗癌疫苗的臨床嘗試。越來越多的有關(guān)這些微泡對免疫系統(tǒng)不同組件所施加的一大批抑制作用的證據(jù)明確支持腫瘤外來體參與了疾病發(fā)展。特別地，最近表明由各種來源的人腫瘤細胞分泌的外來體能夠通過死亡配體(例如FasL、TRAIL)的表達在激活的T細胞中引起細胞凋亡，并且能夠抑制NK功能和促使從正常單核細胞生成骨髓源抑制細胞。這些數(shù)據(jù)連同腫瘤可能來源的外來體可以在癌癥患者的血漿和腫瘤滲漏中大量存在這一可復現(xiàn)證據(jù)支持了腫瘤外來體在影響宿主微環(huán)境以允許腫瘤細胞生長和發(fā)展中的作用。

考慮到對外來體在癌癥發(fā)展中的作用理解的深入以及對發(fā)現(xiàn)新治療、改善對腫瘤惡性程度以及生長的診斷和隨訪的需求不斷提高的這一事實，因此需要檢測和測定人體液中外來體的方法和工具。然而，事實上目前用于檢測外來體的方法不是非定量的(TEM)，就是定量性較差(WB)。盡管流式細胞術(shù)已用于定量外來體，但該方法不能進行研究人員需要的精確測定。事實上，雖然FACS(熒光激活細胞分選法)分析是定量細胞(即使是小尺寸細胞)的合適方法，但是它不適合于對這些小囊泡(即50-100nm)的量進行定量。此外，總平均熒光的粗略測定不能對給定樣品中存在的微泡數(shù)量進行精確定量。此外，F(xiàn)ACS分析不允許同時分析不同的樣品。因此，需要對來自少量體液的外來體進行檢測和定量的方法。此外，考慮到癌癥早期診斷對疾病治療至關(guān)重要這一事實，需要潛在的腫瘤標志物和預后因子。

發(fā)明簡述

獲得有關(guān)外來體的有用體內(nèi)數(shù)據(jù)的主要問題為從人體液(特別是從血漿)獲得外來體以對其進行定量和表征的目前可用方法的效率水平較低。所述體液也可以是腹水、腦脊液、骨髓、尿液、糞便或支氣管肺泡洗液。為了提供目前所面臨的這些問題的解決方案，本發(fā)明公開提供了對來自體液(特別是來自人血漿)的外來體進行檢測和定量的簡單可靠的方法。根據(jù)本發(fā)明公開，基于ELISA的檢測(稱為ExoTest)允許對來自健康供體和腫瘤患者人血漿的外來體進行定量和表征。通過該測試，有可能對來自移入人黑素瘤或結(jié)腸癌細胞的SCID小鼠以及腫瘤患者的血漿的外來體樣微泡進行表征。本發(fā)明公開顯示血漿外來體水平與腫瘤大小直接相關(guān)，并且僅在從腫瘤患者血漿純化的外來體中可檢測到窖蛋白-1。根據(jù)本發(fā)明公開，人患者血漿中腫瘤外來體的檢測在人惡性腫瘤的診斷和隨訪中是有用的。

本文公開的技術(shù)允許進行在腫瘤診斷、隨訪和篩選的臨床實踐中有用的非侵入性測試。根據(jù)本發(fā)明公開所述的技術(shù)還在腫瘤的臨床研究中有用。此外，正如已知可以在細胞釋放的外來體內(nèi)或在血漿中檢測到一些病毒(例如，HIV和HCV)以及朊病毒，本發(fā)明公開所述的技術(shù)還可以用于表征和研究其它疾病，如病毒、傳播性和自身免疫性疾病。此外，基于在外來體上表達的蛋白(例如，腫瘤標志物、病毒蛋白、朊病毒蛋白)，本發(fā)明提供了改善現(xiàn)有臨床測試的工具。

本發(fā)明的原理基于兩個要點：