[發明專利]底物偶聯珠的長期儲存方法

無效

• 申請號: 200980110711.1
• 申請日: 2009-03-13
• 公開（公告）號: CN101981450A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發明（設計）人: T·亨茨勒;T·赫格特
• 申請（專利權）人: 默克專利有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 黃革生;林柏楠

本發明涉及底物偶聯珠的長期儲存方法，所述底物偶聯珠為生物反應、優選酶促反應而制備。適用于這一方法的珠可以是無機或者有機的。優選地，這一方法使用聚苯乙烯珠。

發明背景

對于具有改善活性的新型藥物的開發，重要的是尋找在誘發疾病中起作用的特異靶點。為了這一目標和設計新型治療方法，創造了適合平行測試大量靶點的測試方法，例如在96孔板中進行。過去開發了不同的系統，現在仍在繼續改善。非常精密的篩選系統，是基于小型特制聚合物珠的應用，所述聚合物珠在生物醫學應用中，用于簡化生物系統的分離，定位生物學相互作用和擴大信號。在這一領域中，研究者可以選擇適合其特殊篩選問題的系統。

表1：珠的性質比較(Drug?Discovery?Today，卷5，增刊1，1?June2000，頁38-41)

所有這些基于珠的技術的開發，是為了使基于光學性質的簡單分離或靈敏檢測更加便利。基于對已用兩個變濃度熒光團進行內部染色的珠的流式細胞分析，系統當前可以在單管或單孔中測定例如高達100種分析物(J.Zimmermann，Micro?array?technology?advances?fortherapeutic?target?discovery，Gen.Eng.News?19(1999)，p.1-34)。橙色相對于紅色內部熒光團的比例可以區分微球體的分離群(separatesets)。如抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)等表面蛋白質促進主要配體附著，而綠色熒光標記提供分析物的定量。因為平行鑒定大量靶分子的這一方法是非常精細的程序，大多數情況下在藥物開發程序中選用這一分析方法。

特別地，主要使用技術。它基于聚苯乙烯珠，所述聚苯乙烯珠如上所述(WO2006/044413?A2，US?7,141,431?B2，EP?1?208?382B1，WO?2007/103859?A2，WO?2006/044275?A2)用兩種不同熒光染料進行彩色編碼。所用的珠顯示的平均粒徑約等于6μm，特別是約5.6μm。

這些珠的編碼，是通過將其加入含有熒光染料特殊混合物的溶劑來完成的。珠膨脹并通過擴散來吸收染料。在用于去除多余染料的幾個清洗步驟后，溶劑被蒸發，并且內部帶有編碼熒光染料的珠收縮到它們最初的大小。

這些編碼的珠可以在特殊的流式細胞儀中檢測，用一個激光檢測珠本身的熒光，用另一個激光檢測偶聯物質或大分子的熒光報告信號。

這表示，用635nm激光激發時，兩種熒光分類染料在不同波長上(657nm和730nm)發射熒光。這些熒光染料不同濃度的組合最終成為100種不同的珠類型。第三種熒光染料用作報告分子。這樣的報告染料例如藻紅蛋白，是由第二個激光激發的(532nm)。報告熒光是珠表面上有陽性反應的指示。

這100種不同的珠的區域會帶來100個平行實驗的可能，所述實驗可以用一個樣品在一個孔中以多路形式實現。因此，這一系統能滿足多種應用的需要，例如：蛋白質表達譜、焦點基因表達譜、自身免疫疾病、遺傳病、分子傳染病和HLA測試。珠可以便利地功能化。

功能化可通過由核苷酸或氨基酸組成的生物分子進行。特別地，珠可以通過蛋白、肽類或環肽類來進行功能化。

在優選的實施方案中描述的珠與抗體或其他連接體(binder)相結合，所述連接體例如支架蛋白，如anticalins、ancyrin重復蛋白(ancyrinrepeat?protein)，半胱氨酸-結蛋白(cystein-knot?protein)，納米抗體(nanobody)等等。在另一個優選的實施方案中，珠用例如磷酸酶、激酶、脂肪酶等酶來進行功能化。但它們也可以用核苷酸序列來進行功能化。這些核苷酸序列可作為引物、DNA或RNA片段、如適體等連接分子或更大的DNA或RNA結構存在。通過例如抗體或其他結構進行的所述珠的功能化，可通過NHS-化學作用或標簽的共價偶聯來完成，所述標簽被相應的親和配體捕捉，例如His-標簽-Ni²⁺-NTA、GST-標簽-谷胱甘肽，S-標簽-S蛋白。

功能化的珠可應用于分析測定反應的生物學反應中。對于這些應用，重要的是反應物的活性可靠并保持恒定。

如上所述，技術的典型應用是三明治免疫測定，該測定中捕捉抗體偶聯到珠上。分析物從例如細胞裂解液等蛋白質混合物中進行捕捉，并且可以通過藻紅蛋白標記的檢測抗體來進行檢測。使用該技術的結果是在一個孔中可平行進行幾個常規ELISA。