[發明專利]在液體培養基中使用細胞裂解實時檢測微生物的方法

有效

• 申請號: 200980109069.5
• 申請日: 2009-03-12
• 公開（公告）號: CN101970683A
• 公開（公告）日: 2011-02-09
• 發明（設計）人: D·莫斯蒂科內;J-C·雷蒙;T·索菲亞;A·維蒙
• 申請（專利權）人: 生物梅里埃公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 林曉紅

本發明領域是臨床或工業微生物學測試領域。更特別地，其涉及通過與富集樣品中的微生物同時進行的細胞裂解反應鑒別一或多種微生物的方法。

微生物學分析需要精確技術，其中獲得結果的時間應該盡可能短。

在醫學領域，需要預測和診斷感染風險：診斷越快及越精確，患者治療越有效及傳播風險越低。該方法對于動物健康是類似的。

在食品加工領域，規范是相同的。但是這些規范區分病原微生物及其毒素，這種研究適用于上市產品，非病原微生物，其沿生產線從初級產品至最終產品用作生產方法的質量指標，及技術上如發酵感興趣的細菌。推測的污染物的快速精確檢測使得可以測試它們并且因此啟動正確的措施。

技術上，微生物學分析可以實施一或多個階段的預富集/富集(pré-enrichissement/enrichissement)，一或多個階段的檢測，一或多個階段的微生物計數。對于特殊應用如食品加工微生物學測試，也可能需要證實階段，以符合該領域中的強制標準。

預富集/富集階段需要本領域技術人員熟知的選擇性或非選擇性培養基。基于常規培養基配方的經常為液體形式的現成使用的培養基是商業可獲得的。

檢測階段基于證實待檢微生物的代謝特征。常規使用特異的酶底物。這些酶底物通常由兩部分組成，第一部分特異于待揭示的酶活性，也稱為靶部分，第二部分作用為標記，也稱作標記部分，通常由生色團或熒光團組成。通過選擇這些底物，根據是否有反應，可以鑒定微生物性質或者區分各種微生物群。因此，顏色或熒光的出現或消失將是微生物屬或類型的特征。關于這一點，使用生色培養基使得能同時檢測和鑒別待檢微生物。其簡化了方法并且大大降低了獲得結果所需的時間。具體舉例可以提及的是申請人的ChromID培養基。這些生色培養基基于檢測特異于待檢微生物的代謝特征，例如大腸桿菌(Escherichia?coli)的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。但是，一些微生物或者一些亞型例如大腸桿菌O157:H7不顯示任何特異酶活性，因此不能用生色培養基檢測。

證實階段部分更特別與食品加工領域的微生物學分析相關。具體地，當先前開發方法的結果是陽性時，需要證實存在待檢病原體。這意味著需要額外測試及使用不同于第一次分析中使用的檢測原理。基于待檢微生物的基因組特征的分子生物學技術構成了用于證實所述鑒別的一種手段。例如，可提及的是常規擴增技術如PCR(聚合酶鏈反應)和NASBA(基于核酸序列的擴增)，它們可以與本領域技術人員已知的實時檢測技術結合。

免疫測定構成另一種用于證實測試的技術。它們利用待檢微生物的免疫原性特征。非限制性例子為競爭或夾心ELISA(酶聯免疫吸附測定)技術或者免疫凝集技術，檢測待檢微生物的表位。后一方法利用功能化固體支持物如用單克隆抗體或多克隆抗體包被的珠(例如膠乳顆粒)，所述功能化支持物與生物學樣品接觸，如授權的歐洲專利EP?0?701?624及EP?1?199567所述。或者，如專利US-4,659,658所述，固體顆粒可以用與位于給定微生物表面上的糖特異結合的凝集素包被。在任何情況下，凝集的出現使得可以明確鑒別待檢微生物。

樣品中微生物的完整精確鑒別因此需要若干步驟順序：富集、檢測、證實。日常使用的測試的標準化已能使檢測方法自動化，但是其進行起來還是很慢。現有技術的一個缺點是事實上這些步驟依次進行。另一個缺點是用于證實步驟的特異相互作用反應，其是免疫學反應或者分子雜交反應，通常在“終點”讀取。在這期間，在食品加工業，終產品的完整批次被阻斷而等待證實結果，在臨床時期，相關抗生素治療和預防措施的建立被延遲。

考慮到現有技術，因此缺少組合了富集、檢測和精確鑒別步驟的方法。具體地，這種方法能將快速、特異性和靈敏性組合在一起。

本發明因此通過在液體培養基中同時使用微生物培養和通過所述微生物的至少一種細胞裂解反應而克服了上述缺點。

更具體地，本發明首先涉及檢測和鑒別可能存在于樣品中的至少一種靶微生物的方法，包括步驟：

a)在容器中將能生長和/或檢測靶微生物的培養基、所述樣品及能被靶微生物裂解的細胞群接觸；

b)將所述全部物質置于促進靶微生物生長和/或檢測的溫度；

c)當步驟b)完成時，實時觀察所述細胞群的裂解，其中在檢測所述靶微生物時所述細胞群的裂解指示所述靶微生物的存在或者證實所述存在。

本發明的另一個主題涉及檢測和鑒別可能存在于樣品中的至少一種靶微生物的方法，包括步驟：

a)在容器中將能生長和/或鑒別靶微生物的培養基、所述樣品及能被靶微生物裂解的細胞群接觸；

b)將所述全部物質置于促進靶微生物生長和/或鑒別的溫度；及