[發(fā)明專利]使用轉(zhuǎn)座子的用于轉(zhuǎn)化的載體、通過該載體轉(zhuǎn)化的微生物及用其生產(chǎn)L-賴氨酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980107004.7
• 申請日: 2009-04-10
• 公開（公告）號: CN102027119A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張在佑;林相曹;崔宗秀;金喆河
• 申請（專利權(quán)）人: CJ第一制糖株式會社
• 主分類號: C12N15/64
• 分類號: C12N15/64
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種使用轉(zhuǎn)座子基因以用于轉(zhuǎn)化的載體、用所述載體轉(zhuǎn)化的微生物以及用所述微生物制備賴氨酸的方法。

背景技術(shù)

棒狀桿菌，尤其是谷氨酸棒桿菌是一種用于生產(chǎn)L-氨基酸的革蘭氏陽性微生物。L-氨基酸，特別是L-賴氨酸廣泛用于生產(chǎn)動物飼料，人用藥物及化妝品。該氨基酸是通過棒狀桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的。

L-賴氨酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法一般是使用這樣的棒狀桿菌，其具有增強的L-賴氨酸生物合成相關(guān)基因。例如，美國專利US6,746,855記載了一種通過培養(yǎng)棒狀桿菌屬(Corynebacterium?sp.)生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，所述的棒狀桿菌屬(Corynebacterium?sp.)中的賴氨酸釋放載體基因lysE得到了增強，同時還導(dǎo)入了選自下組中的另一基因，該組基因由編碼二氫吡啶二羧酸合成酶的dapA、編碼天冬氨酸激酶的lysC、編碼丙酮酸羧化酶的pyc和編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的dapB組成。并且，美國專利6,221,636記載了一種用重組DNA轉(zhuǎn)化的棒狀桿菌，其對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制基本不敏感，所述重組DNA包含編碼二氨基庚二酸鹽脫羧酶和天冬氨酸激酶的DNA序列。

在缺乏抗生素抗性序列的情況下增強所述的L-賴氨酸生物合成相關(guān)基因，可以提高基因的拷貝數(shù)也可以通過突變提高酶活。迄今為止有兩種提高基因拷貝數(shù)的方法。

提高基因拷貝數(shù)的兩種方法之一是在其內(nèi)部原有基因的旁邊再插入額外的基因形成串聯(lián)重復(fù)序列。另一種方法是在棒狀桿菌屬(Corynebacterium?sp.)染色體區(qū)的一個或多個地方插入額外的基因(US7,160,711)。然而，這些方法均受限于基因插入位點，在插入多個基因時非常困難。為克服該問題，人們試圖在基因組rDNA的多拷貝區(qū)插入靶基因。據(jù)報道，該方法比之前的方法更成功。盡管如此，由于破壞兩個或更多個rDNA拷貝會影響微生物的生長，因此該方法仍有不足。

轉(zhuǎn)座子也稱為插入序列元件，是一種能在染色體或質(zhì)粒上移動的序列。轉(zhuǎn)座子包括轉(zhuǎn)座酶，轉(zhuǎn)座酶具有識別特定的插入序列的活性。迄今為止，各種細菌中已有數(shù)百種轉(zhuǎn)座子被報道(TRANSPOSON-BASEDSTRATEGIES?FOR?MICROBIAL?FUNCTIONAL?GENOMICS?ANDPROTEOMICS(2003)Annual?Review?of?Genetics?37：3-29Finbarr?Hayes)。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題

本發(fā)明人試圖利用轉(zhuǎn)化載體生產(chǎn)一種能生產(chǎn)高濃度賴氨酸的菌株，所述載體可與位點無關(guān)地插入兩個或更多靶基因的拷貝而不抑制該微生物的生長。本發(fā)明人證實使用轉(zhuǎn)座子基因的用于轉(zhuǎn)化的載體對插入外源基因非常有用，并最終完成了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種使用轉(zhuǎn)座子基因的用于轉(zhuǎn)化的載體。

本發(fā)明的另一目的是提供一種棒狀桿菌屬微生物，其通過由所述轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化而具有增強的賴氨酸生產(chǎn)能力。

本發(fā)明的另一目的是提供一種由所述棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)培養(yǎng)液生產(chǎn)賴氨酸的方法。

技術(shù)方案

為完成上述目標，本發(fā)明提供一種包含轉(zhuǎn)座子基因和多克隆位點的用于轉(zhuǎn)化的載體。

本發(fā)明還提供一種棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)微生物，其通過由所述用于轉(zhuǎn)化的載體轉(zhuǎn)化而具有增強的賴氨酸生產(chǎn)能力。

本發(fā)明還提供一種由所述棒狀桿菌屬微生物的培養(yǎng)液生產(chǎn)賴氨酸的方法。

有益效果

本發(fā)明提供一種能夠生產(chǎn)高濃度賴氨酸的棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)微生物。其通過將天冬氨酸激酶基因(lysC)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(asd)、二氫吡啶二羧酸合酶基因(dapA)和二氫吡啶二羧酸還原酶基因(dapB)連續(xù)的插入到棒狀桿菌屬基因組上將轉(zhuǎn)座子基因作為多拷貝存在的區(qū)域，從而提高了內(nèi)源生活性，同時還將棒狀桿菌原本沒有的果糖激酶基因(srk)額外地插入到轉(zhuǎn)座子基因區(qū)域從而被賦予了新的活性。

附圖說明

根據(jù)隨后描述的優(yōu)選實施方式和附圖，本發(fā)明所述物品、特點和優(yōu)點將更加顯而易見。附圖中：

圖1是棒狀桿菌染色體插入載體pDZTn的示意圖。

圖2是棒狀桿菌染色體插入載體pDZTn-lysC/asd的示意圖。

圖3是棒狀桿菌染色體插入載體pDZTn-dapA/dapB的示意圖。

圖4是載體pDZTn-srk的示意圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種包含轉(zhuǎn)座子基因和多克隆位點的用于轉(zhuǎn)化的載體。