[發明專利]生產連續細胞系的方法

無效

• 申請號: 200980106313.2
• 申請日: 2009-02-20
• 公開（公告）號: CN102016027A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發明（設計）人: 曼弗雷德·賴特爾;沃爾夫岡·蒙特;西蒙·費格爾;西蒙·馮菲爾克斯
• 申請（專利權）人: 巴克斯特國際公司;巴克斯特醫療保健股份有限公司
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N15/85
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 張穎;樊衛民

發明領域

本發明涉及生產細胞系的方法。

發明背景

細胞系已成為用于疫苗制造的有價值的工具。一些重要疫苗和病毒載體的生產仍然在雞胚或雞胚原代成纖維細胞中進行。用于病毒復制的禽類原代組織由SPF(無特定病原體)生產廠提供。SPF來源的組織昂貴，并且原料供應的質量通常難以控制。因此，供應的不一致性和短缺是基于SPF蛋技術的最主要缺點。對于使用原代成纖維細胞單層培養物的方法來說，同樣也是這樣。為了無限地增殖細胞系，需要將細胞永生化。目前使用的大多數永生化細胞系是癌細胞或融合的雜交瘤細胞的后裔。但是，后一種技術受到與骨髓瘤細胞融合的限制。不存在能夠產生不同類型的永生化細胞的通用技術。

發明簡述

本發明的目的是從不連續的細胞材料生產連續細胞。具體來說，目的是提供不引入外來病毒基因的具有增殖潛力的連續細胞系。

因此，本發明提供了一種用于生產連續細胞系的方法，所述方法包括提供動物或人類的活細胞，用紫外光輻照所述細胞，增殖所述細胞，以及選擇在至少20次傳代后能夠增殖的細胞作為連續細胞系的細胞。

這樣的連續細胞系是能夠增殖并用于生物分子例如蛋白質的重組表達，或用于制造病毒產品例如病毒抗原或完整病毒群，特別是用于疫苗接種目的的細胞的培養物。

因此，本發明還提供了一種生產病毒的方法，所述方法包括提供可通過本發明的方法獲得的連續細胞系的細胞，用所述病毒感染所述細胞，在所述細胞中增殖所述病毒，以及收集所述病毒。

另一方面，本發明提供了一種生產重組基因產物的方法，所述方法包括提供可通過本發明的方法獲得的連續細胞系的細胞，用編碼所述基因產物的核酸轉染細胞，表達所述基因產物，以及任選地收集所述基因產物。

另一方面，本發明提供了可以通過一種方法獲得的連續細胞系，所述方法包括提供動物或人類的活細胞，用有效劑量的紫外光輻照所述細胞，增殖所述細胞，以及選擇在至少20次傳代后能夠增殖的細胞作為所述連續細胞系的細胞。

附圖說明

圖1顯示了UV處理步驟的流程。

圖2顯示了鵪鶉的連續細胞培養物。

圖3顯示了生產鵪鶉連續細胞系的系統樹以及處理路線。

圖4顯示了采用用于生產連續細胞的設置，UV劑量與輻照時間的相關性。

發明詳述

本發明提供了通過細胞的UV處理來生產連續細胞系。

細胞系是由原代細胞培養物的一個或多個傳代培養物形成的細胞群。每輪傳代培養被稱為傳代。當細胞被傳代培養時，它們被稱為已被傳代。特定細胞群、或細胞系，可以由它已被傳代的次數來表征。原代培養物是細胞從組織分離后的第一代培養物。在第一次傳代培養后，細胞被描述為第二代培養物(一次傳代)。在第二次傳代培養后，細胞變成第三代培養物(兩次傳代)，依此類推。本領域技術人員將會理解，在傳代期間可能存在多次群體加倍；因此，培養物群體加倍的數量大于傳代次數。傳代之間的時間中細胞的擴增(即群體加倍的數量)取決于許多因素，包括但不限于接種密度、基底、培養基、生長條件和傳代之間的時間。培養可以通過接種細胞培養基，使細胞生長至細胞形成匯合細胞培養物或連續的膜，并用一部分匯合細胞接種新的細胞培養基來進行。然而，傳代是評估增殖能力的工具。一般來說，從組織分離到的細胞、包括未輻照細胞，在它們達到不發生進一步增殖或細胞加倍的狀態之前，能夠傳代約10-20次。然后細胞進入衰老狀態，不能從其獲得進一步的傳代培養。與此相反，連續細胞系在20次以上傳代之后、例如在22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75或80次以上傳代之后能夠增殖?，F在，本發明人已經發現，這種在第20次傳代后能夠傳代多次的連續細胞、特別是永生化細胞，可以通過用UV處理改變細胞、即通過用有效劑量的UV光輻照這些細胞來獲得。本發明的術語“有效劑量的UV光”是將非連續細胞系轉化成連續細胞系所需的輻照的量。有效劑量的UV光的范圍，從這種轉化所必需的最小劑量直到這些細胞所耐受的對細胞培養物整體沒有致死結果的最大劑量。顯然，高于或低于有效劑量限度，不能獲得連續細胞系。本領域技術人員在本文中獲得的信息和指導的基礎上，經常規的最適化過程就能容易地確定每個細胞系的最適有效劑量。細胞可以是原代細胞或幾次傳代后能夠增殖的細胞。細胞系的培養可以使用標準的細胞培養技術來進行，例如在T型瓶系統或轉瓶系統中，或在攪拌釜或其他生物反應器形式中。在本發明的幾種實施方案中，培養物適合于并保持在無血清條件下。