[發明專利]等溫檢測方法及其應用

無效

• 申請號: 200980102090.2
• 申請日: 2009-01-08
• 公開（公告）號: CN101970677A
• 公開（公告）日: 2011-02-09
• 發明（設計）人: D·J·索羅;L·S·佩恩
• 申請（專利權）人: 賽進有限公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 鄧琪

相關申請

本申請要求2008年1月8日提交的美國臨時申請No.61/019,809的優選權。

技術領域

該公開涉及核酸化學和分子遺傳學領域。更具體而言，本發明涉及聯合使用酶的多元件(multi-element)多核苷酸探針在檢測生物樣品中的特定核酸序列中的應用。

背景技術

存在多種這樣的情況，其中期望檢測復雜混合物背景中的低水平的特定核酸序列。例子包括(但不限于)檢測醫學或環境病原體，或檢測特定基因的等位基因以鑒定基因異常。在所有情況下，旨在用于此目的的方法必須具有高特異性和高敏感性。優選的方法還應該耐用的、在應用中相對簡單的和廉價的。使用DNA或RNA檢測，檢測體系可能是必需的，其足夠敏感來檢測單一分子(或至多一些分子)，原因在于一種靶序列可表示具有引起廣泛疾病潛力的單一傳染劑。

目前不存在這樣的簡便方法，其可直接檢測特定序列的單一核酸分子，并且所有目前使用的方法都包括一個或多個放大信號的步驟。由于DNA具有制備其本身拷貝的固有能力，因此可以使用模擬細胞復制的體內過程的靶序列的體外復制，從而擴增復雜混合物中靶多核苷酸的數量，使得它們可在具有需要的敏感度的情況下被識別。

大多數DNA合成(除了短鏈DNA(例如寡核苷酸)的合成之外)通過酶法來進行，其中使用DNA聚合酶。用于實現該目標的最常用的方法是聚合酶鏈式反應(PCR；如美國專利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159中詳細描述)。該方法通過使用熱循環和耐熱性DNA聚合酶而提供靶分子的幾何擴增。使用高溫將兩個互補DNA鏈變性(分開)，然后使用低溫促進通過引發和通過聚合酶的鏈合成。因此，PCR合成法使用這樣的反應來進行，所述反應包括三個步驟，每個步驟在不連續溫度下發生。PCR產物的檢測可通過下列方式實時監控：Taq?DNA聚合酶(具有5’-3’核酸外切酶活性)介導的下游寡核苷酸的降解(Gelfand，1993)，或者使用熒光嵌入染料，所述染料在結合至雙鏈DNA時發出更大強度的熒光。允許RNA靶的擴增和檢測的PCR反應方案的改進是逆轉錄-PCR(RT-PCR)法，其是PCR和逆轉錄反應的組合，這在Trends?in?Biotechnology，10：146-152(1992)中有所描述。

通常應用于分子診斷學領域的PCR方法的基礎是其借助于擴增靶核酸而獲得期望的信號水平，進而檢測這些擴增產物。相反，連接酶鏈式反應(LCR)通過探針本身構象的幾何級數增加而實現信號放大(Barany，1991)。在該方法中，DNA連接酶在存在靶互補鏈的情況下結合兩個寡核苷酸。所得連接的形式成為用于第二對引物的互補寡核苷酸。LCR的一個示例性應用是在性傳播疾病Chlamydia的檢測中。其以試劑盒的形式出售(Roche?Cobas，Roche?Amplicor板式試劑盒)。

上述方法中的固有不足在于需要反應在高溫和低溫之間反復循環-例如，在PCR的情況下在促進各輪模板變性和引物退火/延伸的溫度的循環之間循環。因此，反應體系使用不連續相或循環來進行，原因在于反應受到上述溫度的限制。因此，所述方法花費更長時間來進行，因為在各相要求的時間是不清楚的，并且還因為設備需要重復改變孵育溫度。在調節溫度方面損失的時間和循環數成比例增加。另外，所述方法需要使用昂貴的可在時間內精確地調節至較寬溫度范圍的熱循環機。其是難以小型化的專門設備，并且需要不間斷的電源供應。因此，這些要求極大地妨礙了PCR基分子診斷在使用點測試中的應用。

針對這些限制，人們花費很多努力來開發等同于PCR的單一溫度(等溫)法。等溫法通常通過使用聚合酶而消除了部分熱循環問題，所述聚合酶同時實現鏈置換和鏈合成，進而除去高溫變性步驟的需要。這種等溫核酸擴增法的例子包括鏈置換擴增(SDA)法(如JP-B?7-114718中所述)、和各種改進SDA法(如美國專利No.5,824,517、以及PCT國際專利申請公開WO?99/09211、WO?95/25180和WO?99/49081中所述)。用于特定核酸擴增的其他等溫反應包括自主序列復制(3SR)法、核酸序列基擴增(NASBA)法(如日本專利No.2650159中所述)、轉錄介導的擴增(TMA)法、和Q.beta.復制酶法(如日本專利No.2710159中所述)。寡核苷酸的等溫酶合成法在美國專利No.5,916,777中有所描述。