[發明專利]禽類的糖基化

無效

• 申請號: 200980102076.2
• 申請日: 2009-01-07
• 公開（公告）號: CN101932231A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發明（設計）人: A·J·哈維
• 申請（專利權）人: 辛那杰瓦生物制藥股份有限公司
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/54;C12N15/09
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 楊昀

相關申請信息

本申請要求2008年1月7日提交的美國臨時申請號61/010,207的權利，并將其整體納入作為參考。

背景

某些具有潛在商業用途的蛋白質需要翻譯后修飾，這些修飾可由哺乳動物細胞有效產生。然而，哺乳動物細胞，如工業標準中國倉鼠細胞(CHO)，在GMP條件下難以生長，如果繁殖至商業目的所需規模需要大量資源。基于動物的反應器系統因為其低成本、低維護且易于規模化，是具有吸引力的基于CHO和其它哺乳動物細胞的系統的替代品。然而，治療性蛋白質的翻譯后修飾，尤其是糖基化，與哺乳動物細胞如CHO細胞相比，在某些動物和植物中執行方式不同。轉基因禽類，部分因其高效產卵和產生蛋白質的能力，已成功用作治療性蛋白質的生物反應器。在一些例子中，發現與禽類如雞的輸卵管產生的并存儲于卵的蛋白質相連接的糖分子(即寡糖或糖基化結構)具有CHO和人類蛋白質相似的基本結構。然而，輸卵管中產生的某些蛋白質中并不出現某些結構性糖元件，這些結構性糖元件對于蛋白質在病人中的生物反應性和生物利用度至關緊要。

當卵黃在輸卵管(哺乳動物輸卵管的禽類等價物)中行進時在其周圍形成卵清。輸卵管中卵清形成的部分叫做輸卵管膨大部(magnum)，由專門負責合成并分泌卵清蛋白質的稱作管狀腺細胞(TGC)的細胞聚集而成。

蛋白質中的兩類主要的糖基化結構，N-和O-連接的寡糖，由不同的酶的集合合成。對于產蛋母雞的輸卵管膨大部產生并存儲于卵清中的O-連接的寡糖(也稱作O-聚糖)，寡糖產生所用的酶機器似乎與人O-聚糖產生所用的類似，因為在人和禽類輸卵管中產生的寡糖結構中出現完全相同的糖和連接。

母雞卵清N-連接寡糖(也稱作N-聚糖)具有與人中那些某種程度相似的結構，但通常缺少末端的半乳糖和唾液酸糖。對于某些治療性蛋白，末端的半乳糖和唾液酸也許對于病人中的生物利用度以及因此產生的效果至關緊要。

末端的唾液酸殘基在母雞輸卵管產生的N-聚糖結構中很少出現或根本不出現，它掩蓋N-聚糖不被各種凝集素(識別糖分子的受體)識別。末端具有Gal的蛋白質可被肝臟中表達的凝集素結合并從病人的血液循環中清除(Ashwell和Morell.Adv?Enzymol?Relat?Areas?Mol?Biol?41：99-128，1974)。具有含末端GlcNAc的N-聚糖的蛋白質，通常如母雞輸卵管產生的蛋白質，或者含末端甘露糖的N-聚糖的蛋白質被巨嗜細胞上表達的凝集素結合，并導致清除(Schlesinger等，Biochem?J?192：597-606，1980)。這些結果可導致蛋白半衰期縮短，并降低效果。

有趣的時，雞的其它器官中產生的N-聚糖，如血液中的那些，通常以Gal和/或唾液酸結尾(Ito等，Rapid?Commun?Mass?Spectrom?20：3557-65，2006；Raju等，Glycobiology?10：477-86.，2000)。因此顯然雞的基因組中包含合成完全唾液酸化N-聚糖所需的酶的編碼基因。

對于來自雞卵清的N-聚糖，一小部分的側鏈被Gal占據，這些Gal中的一小部分帶有唾液酸帽子。對于卵清O-聚糖，絕大部分的側鏈帶有唾液酸帽子。在卵清蛋白質中有相當數量的半乳糖和唾液酸，主要是因為O-聚糖修飾的卵清蛋白質的豐度(Feeney等，J?Biol?Chem?235：2633-7，1960；Feeney等，J?Biol?Chem?235：2307-11，1960；Robinson和Monsey.Biochem?J?147：55-62，1975)。N-和O-聚糖合成通路共享相同的Gal和唾液酸庫(Varki，等，《糖生物學綱要》(Essentials?ofGlycobiology)，紐約普萊恩維尤，冷泉港實驗室出版社(Plainview，NY，Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press，1999)。因此在TGC中用于聚糖合成的Gal和唾液酸水平很高，并不是限制因素。