[實用新型]藏綿羊腐蹄病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒

無效

• 申請號: 200920152847.6
• 申請日: 2009-04-10
• 公開（公告）號: CN201381325Y
• 公開（公告）日: 2010-01-13
• 發明（設計）人: 羅玉柱;胡江;劉秀;王繼卿;馬小軍
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司
• 代理人: 張 真

技術領域：

本實用新型主要涉及動物生物技術領域中的綿羊分子標記輔助育種技術，具體涉及到藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒。

背景技術：

綿羊腐蹄病是由節瘤擬桿菌引起高度接觸性傳染病，其特征是蹄局部組織發炎、壞死。綿羊患病后生長不良、掉膘、羊毛品質下降，病情嚴重且得不到及時治療時會引起羊只死亡。藏綿羊易患腐蹄病，于每年7-9月份的多雨季節爆發，如在甘肅和青海境內的藏綿羊發病率高達30％以上，死亡率最高可達10％，嚴重影響牧區養羊業發展。

動物主要組織相容性(基因)復合體(major?histocompatibility?complex，MHC)與多種疾病有密切關系，是目前開展抗病育種的首選基因座或候選基因。綿羊主要組織相容性(基因)復合體也稱為OLA(ovine?lymphocyte?antigen)，OLA?II區與人的相似，區域內的DQ和DR?2個基因家族表現豐富的多態性，但綿羊的多態性更集中在DQ家族。OLA-DQ基因家族有2個DQA基因座位，即DQA1和DQA2基因，都具有多態性。

目前國內綿羊腐蹄病主要采用藥物防治措施，較難控制病情且有藥物殘留風險。在國外OLA-DQA2基因已經作為抗腐蹄病的遺傳標記加以應用，并且該檢測已商業化并用來開展抗病選育。藏綿羊腐蹄病抗性分子選種技術主要利用PCR-SSCP技術對待測綿羊的DQA2基因第2外顯子進行多態性分析，然后根據檢測結果確定攜帶不同等位基因的羊只對腐蹄病的抗性強弱，從而判斷是否可以留作種用。

實用新型內容：

本實用新型的目的在于避免現有技術的不足之處而提供一種藏綿羊腐蹄病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒。以解決快速、敏感性高、成本低用于藏綿羊腐蹄病抗性分子選種技術。

本實用新型涉及一種藏綿腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒。通過PCR-SSCP對表型正常和患腐蹄病藏綿羊OLA-DQA2基因第2外顯子進行遺傳多態性分析，并克隆、測序群體內變異產生的各等位基因序列，結合表型觀測資料，確定易感等位基因和抗性較強的等位基因，為藏綿羊沒有感染時的抗病選育進行指導。

本實用新型的目的可以通過采用以下技術方案來實現：一種藏綿羊腐蹄病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒，包括有盒體(1)，襯墊(2)，在襯墊(2)上設有數個容器孔，其主要特點是在容器孔中分別放置第一PCR反應液(4)，第二PCR反應液(11)，OLA-DQA2^*L的DNA標準樣(10)。

所述的藏綿羊腐蹄病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒，還包括在容器孔中還分別放置SSCP檢測試劑，去離子水(5)，10％過硫酸銨(7)，變性上樣緩沖液(6)，TEMED(四甲基乙二胺)(8)，聚丙烯酰胺(Acr∶Bis＝39∶1)(9)。

上述各種液體分別裝在容器內，插入容器孔內。

上樣變性緩沖液(6)，包括98％去離子甲酰胺、0.025％溴酚藍、0.025％二甲苯青、10mmol/L?EDTA?pH?8.0。

所述的第一PCR反應液(4)的成分用量及濃度：第一組DQA2-up和DQA2-dn引物各為0.5μL/10pmol，dNTP為1.2μL/2.5mm，Taq?DNA聚合酶為0.2μL/2.5U/μL，10×buffer為2.0μL含Mg²⁺15μM，雙純水為14.6μL。

所述的第二PCR反應液(11)的成分用量及濃度：第二組DQA2s-up和DQA2s-dn引物各為0.5μL/10pmol，dNTP為1.2μL/2.5mm，Taq?DNA聚合酶為0.2μL/2.5U/μL，10×buffer為2.0μL含Mg²⁺15μM，雙純水為14.6μL。

所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的PCR-SSCP特異性擴增引物，第一組引物上游長度為24bp的核苷酸，下游長度為22bp的核苷酸，第二組引物上游長度為23bp的核苷酸，下游長度為24bp的核苷酸，包括用于擴增OLA-DQA2基因第2外顯子的特異性引物，序列如下：

上游引物24bp：DQA2-up：CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC；

下游引物22bp：DQA2-dn：CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG；

上游引物23bp：DQA2s-up：ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT；

下游引物24bp：DQA2s-dn：GGAGTAGAATGGTGGACACTTACC；