[發明專利]羊毛甾醇粗品分離提純的方法

無效

• 申請號: 200910308433.2
• 申請日: 2009-10-19
• 公開（公告）號: CN101691391A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發明（設計）人: 鐘建江;王家樂;李英波
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07J9/00
• 分類號: C07J9/00
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及的是一種有機物提純技術領域的方法，具體是一種羊毛甾醇粗品分離提純的方法。

背景技術

羊毛甾醇是真核細胞甾醇合成途徑中重要的中間體。在人體內，它是膽固醇及多種類固醇激素的合成前體(Crit.Rev.Biochem.Mol.，34(2)，123-140，1999)；在真菌細胞中，它是麥角固醇及多種具有抗癌，消炎，降血脂等生物活性的三萜類化合物的重要前體(Nat.Prod.Rep.，15，653-696，1998；Int.Immunopharmacol.，7，701-724，2007)。因此高純度的羊毛甾醇純品在各種由于甾醇代謝導致的人體疾病和三萜類天然化合物生物合成機制過程的研究中，具有十分重要的地位和作用。目前市售的高純度羊毛甾醇(97％以上)主要由Sigma，TCI，西域等幾家公司所壟斷，售價高達1000元/毫克，難為大部分科研院所所承受。然而隨著近年來人們對于疾病和健康不斷關注，相關方面的研究也愈加迫切，所以廉價地分離制備高純度羊毛甾醇成為一個重要的研究內容。高純度羊毛甾醇分離純化的瓶頸主要在于羊毛甾醇和二氫羊毛甾醇，以及其他固醇類物質的分離(J.Org.Chem.，20(12)，1627-1630，1955)。傳統羊毛甾醇的制備主要有提取法和溴化法兩種。經典的溴化法所用的試劑昂貴，回收率低；傳統的提取法(許菲菲.從羊毛脂中膽甾醇的工藝研究。浙江大學碩士論文.2005)存在步驟繁瑣，周期長，回收率很低，結晶純度差等缺點，需要反復多次才能得到微量的純品。因此，通過以上方法生產的羊毛甾醇純品價格不菲。基于以上背景，一種快速、高效、成本低、純度好的羊毛甾醇分離純化方法急需被開發，建立來滿足市場的需求。

制備型高效液相色譜(Prep-HPLC)是基于20世紀60年代發展起來的高效液相色譜技術的一種新型、高效的分離方法。其原理是利用樣品中不同組分在液固兩相中具有不同的分配系數來進行分離純化。在化合物的制備方面，相比于傳統的分離工藝，Prep-HPLC具有有機溶劑消耗少，污染低，回收高等優點，可以滿足快速，大制備量的分離需求；相比于高速逆流色譜技術，Prep-HPLC分離度更好，重復性更佳，特別適合結構類似物的分離純化。目前，國內外學者已將Prep-HPLC運用于有效天然產物和結構類似物的分離純化中。因此，Prep-HPLC可能是分離純化高純度羊毛甾醇的較好方法。

發明內容

本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種羊毛甾醇粗品分離提純的方法，在低成本和高回收率的情況下滿足羊毛甾醇大量制備的需求，并亦能滿足對于該工藝的重復性以及線性放大的要求。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括以下步驟：

第一步、將羊毛甾醇粗品在25-40℃條件下經超聲處理溶解于有機溶劑中，制成羊毛甾醇溶液；

所述的超聲處理是指將樣品置于超聲清洗儀中超聲促溶，超聲清洗儀功率為40-160W；

所述的有機溶劑為HPLC級甲醇或HPLC級乙腈；

所述的羊毛甾醇溶液的濃度大于等于100μg/ml；

第二步、將羊毛甾醇溶液由過濾膜過濾后用高效液相制備色譜采用重疊進樣進行分離純化處理，得到提純羊毛甾醇；

所述的過濾膜是指：濾膜孔徑為0.22-0.45μm；

所述的提純羊毛甾醇的純度為97％；

所述的高效液相制備色譜為反相高效液相制備色譜，其填充材料為反相硅膠C18，粒徑5-10μm；流動相為100％的HPLC級甲醇或乙腈；定量環為2-10mL，采取滿環進樣，流速為5-25mL/min；柱溫控制在15-25℃，同時采用紫外檢測器210nm在線檢測流出曲線，從而控制接樣時間。

所述的采用重疊進樣的進樣方式是指：所述定量環的容積、流動相的流速及每針間隔時間滿足：T×v＝V；所述的流動相的流速和制備柱內徑滿足：V＝k×d²；其中：T為每次進樣間隔時間，v為柱流速，V為定量環容積，d為制備柱內徑，k為常數。

本發明采用反相高效液相色譜法，能夠保證分離度佳、產量高、回收率高、純度好等特點，能直接分離得到97％以上純度的羊毛甾醇，可以用于各類甾醇相關疾病和多種天然產物生物合成途徑的研發。運用重疊進樣，線性放大等技術彌補了使用反相色譜分離羊毛甾醇溶解度低的劣勢，使用內徑20mm，柱長250mm的制備柱，日制備量可達到近250mg，能滿足多種科研需求。