[發明專利]吸附重金屬鎘的重組惡臭假單胞菌CH01及應用

無效

• 申請號: 200910273441.8
• 申請日: 2009-12-30
• 公開（公告）號: CN101892187A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發明（設計）人: 黃巧云;陳雯莉;李友國;雷磊;王珂征;何小川
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/78;B09C1/10;C12R1/40
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬環境工程土壤環境治理領域。具體涉及一種新的微生物修復重金屬鎘污染土壤的基因工程菌的構建和應用。本發明與微生物基因工程和環境工程領域有關。?

背景技術

鎘是一種典型的分散型重金屬元素，主要以硫化物的形式存在于銅、鉛、鋅等有色金屬礦藏中。隨著人類活動，鎘以各種途徑進入環境中，造成了嚴重的鎘污染。鎘在環境中有穩定積累和不易消除的特點，而鎘遷移轉化的最大特點是不能或不易被生物體分解轉化后排出體外，不易隨水移動，只能沿食物鏈逐級往上傳遞，通過食物鏈富集使人體慢性中毒。研究表明，鎘同時對人類和動物具有致癌作用，鎘污染地區居民的死亡率及癌癥罹患率同非污染地區相比均呈現出上升的趨勢。目前，鎘已被國際癌癥研究機構(IARC)歸為第一類致癌物(McGregor?et?al.，2000)。?

在鎘污染的土壤環境中的植物也會不同程度地吸收該重金屬，使得根、莖、葉等器官及各種細胞器受到不同程度的傷害，使植物生物量下降。植物對鎘的吸收取決于植物根系生理功能及根際圈內微生物群落組成、士壤的理化性質、重金屬種類和濃度、氧化還原電位以及pH值等因素影響。部分植物對包括鎘在內的重金屬有較高的耐受和吸收性能而被用于修復重金屬污染的土壤，但是目前篩選出的富集重金屬的植物往往只對一種重金屬元素表現出較強的富集能力，而對復合污染的幾種重金屬元素同時富集的能力較弱；同時還存在著植物生物量小、生長周期長以及扎根淺等問題。植物根際微生物與植物根系所組成的生態系統對重金屬在根土界面的遷移轉化有著重要的作用。根際微生物對重金屬的吸附轉化和固定能有效降低重金屬對植物的傷害。而微生物對重金屬的耐受和解毒能力也為微生物從功能上治理和修復重金屬污染土壤提供了新的途徑。?

在所有微生物修復重金屬機制中，通過金屬硫蛋白吸附重金屬，特別是難于轉化為低毒或無毒的鎘一類的重金屬受到我們特別的關注。金屬硫蛋白(Metallothionein，簡稱MT)是一類低分子量，富含半胱氨酸，能夠結合Cd、Zn、Cu等多種金屬離子的蛋白質。1957年，Margoshes和Vallee首次從馬腎中分離得到。在重金屬吸附的利用方面，目前主要是將該類蛋白與周質空間或外膜組分融合后在大腸桿菌中表達，或者將MT的表達與金屬膜轉運蛋白的表達相結合(Jacobs，1989；Romeyer，et?al，1990；Sousa?et?al.，1998；Valls?etal.，2000；Valls?et?al.，1998)。但是大腸桿菌對重金屬的耐受能力較弱，而工程菌吸附重金屬后降低了工程菌的有效吸附周期，單個MT分子對于吸附效率和容量的提高也沒有明顯的增強。發明人所分離的一株高度耐受多種重金屬的細菌，初步具備修復多種重金屬污染的能力，同時也為構建高度重金屬污染土壤修復工程菌提供了一個十分有效的宿主。?

微生物表面展示技術是利用基因重組方法把靶蛋白(外源肽段或蛋白質結構域)基因序列與特定的載體蛋白基因序列(又稱定位序列)融合后導入微生物宿主細胞，從而使靶蛋白表達并定位于微生物細胞表面。被展示的多肽或蛋白質可以保持相對獨立的空間結構和生物活性。微生物展示策略能夠將參與重金屬吸附的蛋白質表達在宿主細胞表面，這既增強了修復工程菌與重金屬的接觸，又能降低細胞內的重金屬濃?度，從而增強工程菌的耐受能力。?

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，篩選一種新的微生物修復重金屬鎘污染土壤的基因工程菌。本發明還涉及該基因工程菌的構建和應用。?

本發明的技術方案如下：?

申請人通過基因工程的方法篩選獲得一種能夠修復重金屬鎘污染土壤的基因工程菌CH01，該菌株屬于惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)CH01，于2009年12月19日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為：CCTCC?NO?M209320。?

本發明的基因工程菌的制備方法是，首先將猴金屬硫蛋白α結構域四聚體(mMT4α)融合在野油菜黃單胞菌(Xanthomonas?campestris)ATCC33913冰晶核蛋白N端(inaX-N)，并以此為主要功能單元構建一個廣宿主表達質粒。然后在本發明人所分離的高效耐受多種重金屬的惡臭假單胞菌X4(Pseudomonas?putidaX4)中利用鎘特異性啟動子進行表達，實現猴金屬硫蛋白α結構域四聚體在該細菌的表面展示，從而獲得高效專一吸附重金屬鎘的基因工程菌菌株，將該基因工程菌命名為惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)CH01。?