[發(fā)明專(zhuān)利]重組豬霍亂沙門(mén)氏菌及二價(jià)基因工程疫苗與制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910273372.0
• 申請(qǐng)日: 2009-12-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101838627A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何啟蓋;庫(kù)旭鋼;陳冬煥;徐高原;陳煥春;金梅林
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué);武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/34;C12N15/74;A61K39/295;A61K39/12;A61K39/112;A61P31/04;A61P31/20;C12R1/42
• 代理公司: 武漢宇晨專(zhuān)利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物細(xì)菌基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種不含抗性標(biāo)記的表達(dá)豬II型圓環(huán)病毒Cap蛋白的重組豬霍亂沙門(mén)氏菌活疫苗株的構(gòu)建及應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonella?choleraesuis)是導(dǎo)致2-4月齡仔豬副傷寒的主要病原，感染豬后會(huì)引起急性敗血癥、慢性壞死性腸炎、頑固性下痢等典型癥狀，常引起斷奶仔豬大批發(fā)病，如伴發(fā)或繼發(fā)感染其它疾病或治療不及時(shí)，死亡率較高，造成重大損失。動(dòng)物生前感染沙門(mén)氏菌或其產(chǎn)品受到污染，可使人發(fā)生食物中毒，因此該病原在公共衛(wèi)生學(xué)上也具有重要意義。

人們最早用滅活的全菌疫苗來(lái)預(yù)防沙門(mén)氏菌引起的傷寒，由于滅活苗具有容易引起全身及局部反應(yīng)、只能激發(fā)體液免疫、不能提供交叉保護(hù)、需多次加強(qiáng)免疫等缺點(diǎn)，此類(lèi)疫苗的應(yīng)用受到限制。隨后，人們發(fā)現(xiàn)弱毒沙門(mén)氏菌在誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)方面比滅活的或亞單位疫苗更為有效。于是，各種沙門(mén)氏菌弱毒苗在世界范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用，取得了良好的預(yù)防效果。我國(guó)在60年代初，房曉文等將抗原性良好的豬霍亂沙門(mén)氏菌強(qiáng)毒株接種含有醋酸鉈的培養(yǎng)基中傳數(shù)百代后，選出一株免疫原性好的弱毒株，命名為C500。全國(guó)推廣使用C500后，我國(guó)仔豬副傷寒得到有效控制(黃昌炳等，仔豬副傷寒弱毒通氣培養(yǎng)凍干苗口服免疫研究.國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1981，6：89～94；康凱.仔豬副傷寒活疫苗.中國(guó)獸藥雜志，2003，37：49)。

近30年來(lái)，人們開(kāi)始關(guān)注使用減毒沙門(mén)氏菌作為載體表達(dá)各種外源抗原以預(yù)防重大人、畜傳染病研究領(lǐng)域。應(yīng)用各種基因工程方法構(gòu)建沙門(mén)氏菌減毒株和利用減毒沙門(mén)氏菌作為活載體表達(dá)外源抗原研制多價(jià)疫苗等已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。減毒沙門(mén)氏菌作為疫苗載體具有諸多的優(yōu)點(diǎn)：(1)產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷反應(yīng)(CTL反應(yīng))；(2)減毒沙門(mén)氏菌因侵入淋巴系統(tǒng)，能更有效地激發(fā)宿主的體液和細(xì)胞免疫；(3)通過(guò)自然感染途徑如口服或鼻內(nèi)接種，可以激發(fā)系統(tǒng)和粘膜免疫反應(yīng)；(4)具有免疫佐劑作用；(5)免疫具有持續(xù)性；(6)具有聯(lián)合免疫作用，可以穩(wěn)定表達(dá)原核和真核基因，本身不致病，且可作為傷寒疫苗；(7)所表達(dá)的靶抗原不需提純，制備簡(jiǎn)單，可直接用于免疫保護(hù)試驗(yàn)，顯著降低了疫苗的制作成本；(8)接種簡(jiǎn)單方便，易于操作等(Curtiss，R.，III，T.Doggett，A.Nayak，and?J.Srinivasan.1996.Strategies?for?the?use?of?live?recombinant?avirulent?bacterial?vaccines?for?mucosal?immunization，p.499-511.In?H.Kiyono?and?M.F.Kagnoff(ed.)，Essentials?of?mucosal?immunology.Academic?Press，San?Diego，Calif；S.Spreng，G.Dietrich?and?G.Weidinger.2006.Rational?design?of?Salmonella-based?vaccination?strategies.Methods38：133-143；Sirard，J.C.，F(xiàn).Niedergang，and?J.P.Kraehenbuhl.1999.Live?attenuated?Salmonella：a?paradigm?ofmucosal?vaccines.Immunol.Rev.171：5-26)。重組沙門(mén)氏菌疫苗的發(fā)展常需要使用選擇標(biāo)記，由于以前普遍采用攜帶抗性基因的表達(dá)質(zhì)粒，抗性基因成為體外轉(zhuǎn)化篩選轉(zhuǎn)化子和質(zhì)粒在體外遺傳的的主要標(biāo)記。但是，抗生素是臨床上治療細(xì)菌感染的主要藥物，由此引起的最大恐慌是抗性基因在環(huán)境病原微生物中傳播，從而減弱治療這些病原感染的藥物效果。因此，抗生素抗性質(zhì)粒選擇系統(tǒng)不被人們所接受。如今，人們已經(jīng)研制出多種不含抗生素抗性標(biāo)記的沙門(mén)氏菌疫苗系統(tǒng)，如將外源抗原穩(wěn)定整合到沙門(mén)氏菌染色體，或用能篩選重組菌但不需要抗生素的質(zhì)粒平衡系統(tǒng)(Balanced-lethal?Plasmid?Stabilisation?System)。其中，應(yīng)用最多的系統(tǒng)是asd質(zhì)粒載體平衡致死系統(tǒng)。沙門(mén)氏菌的asd基因編碼天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶(aspartateL-semialdehyde?dehydrogenase)，是二氨基庚二酸(diaminopimelic?acid，DAP)生物合成途徑中的必需酶，而DAP是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁主要化學(xué)成分肽聚糖四肽側(cè)鏈的一個(gè)組分，asd缺失株在無(wú)外源DAP條件下不能形成完好的細(xì)胞壁，最終溶菌死亡。由于哺乳動(dòng)物組織中不含DAP，因此突變菌在不含DAP的培養(yǎng)基中或動(dòng)物體內(nèi)均被降解。將目的基因插入含asd的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化asd宿主菌后可形成互補(bǔ)，asd質(zhì)粒丟失的asd沙門(mén)氏菌在體內(nèi)死亡，只有含有asd質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌才能存活，并穩(wěn)定的在體內(nèi)體外表達(dá)外源抗原。由于用asd質(zhì)粒載體平衡致死系統(tǒng)代替了抗生素抗性標(biāo)記，因此也更加安全。(Nakayama，K.，S.M.Kelly，andR.Curtiss?III.1988.Coe?N?E?and?R?L?Wood.The?effect?of?exposure?to?a?ΔcrpΔcya?mutant?of?Salmonellatyphimurium?on?the?subsequent?colonization?of?swine?by?the?wild-type?parent?strain.Vet?Microbiol，1992，31：207-220.Hassan，J?O，and?R?Curtiss?III.Control?of?colonization?by?virulent?Salmonella?typhimurium?by?oralimmunization?of?chickens?with?avirulent?ΔcrpΔcya?S.typhimurium.Res.Microbiol，1990，141：839-850.Kelly?SM，Bosecker?B?A，Curtiss?R?III.Characterization?and?protective?properties?of?attenuated?mutants?of?Salmonellacholeraesuis.Infect?Immun，1992，60：4881-4890?Construction?of?an?Asd+?expression-cloning?vector：stablemaintenance?and?high?level?expression?of?cloned?genes?in?a?Salmonella?vaccine?strain.Bio/Technology?6：693-697；Kang，H.Y.，J.Srinivasan，and?R.Curtiss?III.2002.Immune?responses?to?recombinant?pneumococcal?PspAantigen?delivered?by?live?attenuated?Salmonella?enterica?serovar?Typhimurium?vaccine.Infect.Immun.70：1739-1749.)。