[發明專利]甘藍型油菜BnGLABRA2啟動子及制備方法和應用

有效

• 申請號: 200910273323.7
• 申請日: 2009-12-18
• 公開（公告）號: CN102102099A
• 公開（公告）日: 2011-06-22
• 發明（設計）人: 白澤濤;董彩華;劉勝毅;柴國華;黃軍艷;劉越英
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種分離的啟動子，其序列為SEQ?ID?NO：1所示的基因啟動子。

2.權利要求1所述的一種甘藍型油菜GL2啟動子GP2的制備方法，其步驟是：

A、基因組步移克隆啟動子序列：

利用SDS裂解法提取基因組DNA，按照基因組步移試劑盒操作程序，進行基因組步移，每次步移擴增兩輪PCR克隆油菜，具體步驟為：提取基因組DNA?25μL，分別用核酸內切酶Dra?I、EcoR?I、Pvu?II和Stu?I酶切，純化后加入接頭形成四個不同的基因組DNA庫，用作首次基因組步移第一輪PCR模板，根據目的基因保守序列設計特異性引物GSP1與試劑盒內上游接頭引物AP1進行擴增，第二輪PCR以第一輪PCR產物的50倍稀釋液為模板，設計引物GSP2和接頭引物AP2進行擴增，進行第二輪基因組步移，所有PCR反應均為50μL擴增體系：模板1μL，dNTPs?0.2mM，引物0.5mM，LA?Taq酶1.25U，10×LA-PCR?buffer5μL，補水至50μL，反應條件均為：94℃預變性1min；98℃10s，72℃6min?7個循環；98℃10s，67℃6min33個循環；72延伸10min，PCR產物經1.0％質量體積比瓊脂糖凝膠電泳檢測，GelExtraction?Kit純化回收后，連接到pMD18-T載體，轉化gold感受態細胞，挑取陽性克隆，酶切驗證后測序，得到目的基因上游的側翼序列；

B、啟動子序列生物信息學分析：

將所克隆序列用BLASTN進行同源比對，啟動子核心元件和上游順式作用元件用啟動子預測軟件進行預測，得到核心啟動子序列和上游啟動子元件；

C、全長啟動子、缺失啟動子的擴增以及pMD18-T-GP載體的構建：

以基因組DNA為模板，根據得到的啟動子序列，設計擴增各缺失片段的引物進行PCR擴增，所有引物的5′端含有Hind?III酶切位點，3′端含有Xba?I酶切位點，反應體系為25μL內含：1×PCR?buffer.，MgCI?1.5mmol/L，dNTP?0.2mmol/L、引物濃度為0.5mol/L，Pfu酶1.5單位，模板約100ng，設置循環參數，PCR產物1.0％質量體積比瓊脂糖凝膠檢測，回收試劑盒回收各目的缺失片段，按各回收的缺失片段∶載體＝3∶1的比例混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，1×反應緩沖液，無菌水補充體積至25ml，16℃過夜連接反應，凍融法轉化大腸桿菌gold菌感受態細胞中，涂布于含有Amp的LB固體平板上，37℃培養過夜，各挑選白斑三個，做菌落PCR檢測，將陽性重組子接種于含Amp?50μg/mL的液體LB培養基，37℃?200r/min振蕩培養過夜，小量堿法提取質粒，Hind?III/Xba?I酶切質粒1μg，0.8％質量體積比瓊脂糖凝膠檢測，檢測正確的陽性重組克隆，為pMD18-X，以M13F/M13R為引物M13?R5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；M13R5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’，將pMD18-X進行序列測定，得到了一種甘藍型油菜BnGL2基因全長啟動子。

3.權利要求書1中所述一種甘藍型油菜BnGL2基因部分缺失啟動子SEQ?ID?NO：1在根部中的應用。

4.權利要求書1中所述一種甘藍型油菜BnGL2基因部分缺失啟動子SEQ?ID?NO：1在整個葉脈中的應用。

5.權利要求書1中所述甘藍型油菜BnGL2基因缺失啟動子SEQ?ID?NO：1在葉片表皮毛中的應用。

6.權利要求書1中所述甘藍型油菜BnGL2基因缺失啟動子SEQ?ID?NO：1在中柱葉脈中的應用。