[發明專利]一種黑曲霉菌株發酵生產纖維素酶和多肽蛋白飼料的制備方法

有效

• 申請號: 200910272714.7
• 申請日: 2009-11-10
• 公開（公告）號: CN101717729A
• 公開（公告）日: 2010-06-02
• 發明（設計）人: 殷臘生;張麒麟
• 申請（專利權）人: 武漢博普奧多肽生產技術有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N9/42;A23K1/00;C12R1/685
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種高產纖維素酶的黑曲霉菌株，其特征在于：該菌株是曲霉屬(Aspergillus) 中的黑曲霉(Aspergillus?niger)2221-P，其保藏號為CCTCC?NO：M209143。

2.權利要求1所述的一種黑曲霉菌株發酵生產纖維素酶的制備方法，其步驟如 下：

A.菌種活化：用含有0.01～0.10％體積比吐溫-80無菌水將孢子制成菌懸液，用 微移液器吸0.5ml孢子懸浮液于PDA培養基的平皿中在20～45℃培養24～100h， 產生孢子；

B.2221-P菌株種子液的培養：將活化好的菌種用0.01～0.10％體積比吐溫-80無 菌水洗成孢子懸浮液，按5～20％質量比的接種量接種于液體培養基中，該培養基為 5～15％質量比的PKC，0.1～0.4％質量比蛋白胨，0.5～1.5％質量比葡萄糖，0.1～0.5％ 質量比硫酸銨，pH?4～8，將接種的搖置于控溫搖床，20～45℃，220rpm培養 24～100h；

C.固體發酵：固體培養基是以PKC為基本碳源基質，經高溫150～300℃一定濕 度20～60％膨化的PKC粉75～90％、大豆粕2～10％、麩皮2～10％、葡萄糖0.4～ 2.0％、蛋白胨0.4～2.0％、硫酸銨0.1～0.6％、碳酸鈣0.1～0.5％，料∶水＝1∶1.0～2.5， pH4～8，先將PKC粉、大豆粕、麩皮和CaCO₃按量稱重，干抖勻，加水再抖勻，分 裝于布袋中在高壓滅菌鍋中115～126℃滅菌30min時，再悶1～2h；將上述固體 培養基配方中的葡萄糖、蛋白胨、硫酸銨按量稱好，加固體培養基10～50％水配制 成懸浮液，115℃滅菌20～30min，冷卻至40～50℃待接種用，將滅菌好的固體料 置于無菌培養室內，待冷卻至40～50℃時，接種液體種子和葡萄糖的懸浮液，液體 種子接種量按固體培養基量的5～20％接種并拌勻，最終，培養基的固體料∶液體 水＝1∶1.0～2.5，液體為拌干料的水，菌種子液和葡萄糖的懸浮液的總量，將接種 好的固體料分裝于淺盤內，厚度1～10cm，淺盤底層用無菌棉布鋪墊，料上面再用 無菌棉布遮蓋，在無菌培養室中保溫20～45℃和保濕RH40～90％培養2～12天，培 養48小時后每天取樣檢測纖維素酶活；

D.后處理：經黑曲霉菌2221-P株接種于固體培養基上發酵后所得固態培養物， 經20～120℃烘干干燥，干燥后經粉碎，過50～200目篩，并檢測酶活。

3.權利要求1所述的一種黑曲霉菌株發酵生產多肽蛋白飼料的制備方法，其步 驟如下：

A.菌種活化：用含有0.01～0.10％體積比吐溫-80無菌水將孢子制成菌懸液，用 微移液器吸0.5ml孢子懸浮液于PDA培養基的平皿中在20～45℃培養24～100h， 產生孢子；

B.2221-P菌株種子液的培養：將活化好的菌種用0.01～0.10％體積比吐溫-80無 菌水洗成孢子懸浮液，按5～20％質量比的接種量接種于液體培養基中，該培養基為 5～15％質量比的PKC，0.1～0.4％質量比蛋白胨，0.5～1.5％質量比葡萄糖，0.1～0.5％ 質量比硫酸銨，pH?4～8，將接種的搖置于控溫搖床，20～45℃，220rpm培養 24～100h；

C.固體發酵：固體培養基是以PKC為基本碳源基質，具體配方是經高溫150～300 ℃濕度20～60％膨化的PKC粉75～90％、大豆粕2～10％、麩皮2～10％、葡萄糖 0.4～2.0％、蛋白胨0.4～2.0％、硫酸銨0.1～0.6％、碳酸鈣0.1～0.5％，料∶水＝1∶1.0～ 2.5，pH4～8，先將PKC粉、大豆粕、麩皮和CaCO₃按量稱重，干拌勻，加水再拌 勻，分裝于布袋中在高壓滅菌鍋中115～126℃滅菌30min時，再悶1～2h；將上 述固體培養基按量稱好，加固體培養基10～80％水配制成懸浮液，115℃滅菌20～ 30min，冷卻至40～50℃待接種用，將滅菌好的固體料置于無菌培養室內，待冷卻 至40～50℃時，接種液體種子和葡萄糖的懸浮液，液體種子接種量按固體培養基量 的5～20％接種并拌勻，最終，培養基的固體料∶液體水＝1∶1.0～2.5，液體為拌干 料的水，菌種子液和葡萄糖的懸浮液的總量，將接種好的固體料分裝于淺盤內，厚 度1～10cm，淺盤底層用無菌棉布鋪墊，料上面再用無菌棉布遮蓋，在無菌培養室 中保溫20～45℃和保濕RH40～90％，培養24～72小時，按固體培養基量的5～20％ 接種已在PDA培養基培養好的酵母種子液，培養24～72小時，按固體培養基量的 5～20％接種已在牛肉肉湯培養基培養好的枯草芽孢桿菌種子液，繼續培養直到預定 時間，整個培養3～12天；

D.后處理：經黑曲霉2221-P菌株接種于固體培養基上發酵后所得固態培養物， 經20～120℃烘干干燥，干燥后經粉碎，過50～200目篩，并檢測多肽蛋白含量。