[發(fā)明專利]一種超高通透性面包酵母及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910272505.2
• 申請日: 2009-10-23
• 公開（公告）號: CN101717736A
• 公開（公告）日: 2010-06-02
• 發(fā)明（設計）人: 肖偉;戴和平;張敏;張曉華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12Q1/02;C12R1/865
• 代理公司: 武漢荊楚聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42215
• 代理人: 王健

1.一種超高通透性面包酵母，其特征在于，該超高通透性面包酵母為缺失CWP1、CWP2、SNQ2和PDR5四個基因的面包酵母。

2.實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種超高通透性面包酵母的制備方法，其特征在于，該方法包含下列步驟：

制備超高通透性面包酵母的方法包含下列步驟：

（1）、從野生面包酵母中提取面包酵母基因組DNA；

1a、取少量面包酵母，接種于5毫升的YPD培養(yǎng)液中，30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)16小時，得到面包酵母菌液；

其中：YPD培養(yǎng)液的配方為：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，余者為水；

1ｂ、取面包酵母菌液1.5毫升，用4000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，沉淀物懸于200微升提取緩沖液中；?

其中：提取緩沖液的配方為：?2%曲拉通X-100,十二烷基磺酸鈉1%,?氯化鈉0.1摩爾,乙二胺四乙酸1毫摩爾,?三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽10毫摩爾,?余者為水，pH?8.0；

1c、加入0.3克酸洗玻璃珠、100微升酚、100微升氯仿，震蕩3分鐘后，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，吸取上層液體；

1d、加入所取液體體積2倍的無水乙醇，在-20℃靜置30分鐘，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，去上清，取沉淀物；

1e、將沉淀物溶解于20微升無菌水，即為面包酵母基因組DNA溶液；

（2）、構(gòu)建cwp1Δ::?hisG-URA3-hisG基因敲除組件

2a、將含有XhoI內(nèi)切酶位點的上游引物?CWP1-1，序列為5′GTACCGAATCGTAGCTCGAGG?3′和含有SphI內(nèi)切酶位點的下游引物CWP1-2，序列為5′GGGAATGTGAGAGCTGCATGC?3′以面包酵母基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到CWP1基因；

其中：PCR?的條件為：94℃?5分鐘；94℃?45秒，52℃?1分鐘，72℃?1分鐘，30個循環(huán)；72℃?10分鐘；

2b、將CWP1基因克隆到pGEM-T載體上,用XhoI內(nèi)切酶和StyI內(nèi)切酶切下一段0.62kb的片斷，再加上BamHI接頭；

2c、用BamHI內(nèi)切酶從pNKY51上切下一段含有hisG-URA3-hisG的?3.8-kb片斷，接入BamHI接頭；

2d、用XhoI–SphI酶切，得到cwp1Δ::?hisG-URA3-hisG基因敲除組件；

（3）、構(gòu)建cwp2Δ::?HIS3基因敲除組件

3a、將含有EcoRI內(nèi)切酶位點的上游引物?CWP2-1，序列為5′GTAGAATTCCCGCACCTTATACGCGC?3′和含有BamHI內(nèi)切酶位點的下游引物CWP2-2，序列為5′GCTGGATCCGTGATTTGAGAAATGGCG?3′以面包酵母基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到0.5kb?CWP2基因EcoRI-BamHI序列；

其中：PCR?的條件為：94℃?5分鐘；94℃?45秒，52℃?1分鐘，72℃?1分鐘，30個循環(huán)；72℃?10分鐘；

3b、將含有BamHI內(nèi)切酶位點的上游引物?CWP2-3，序列為5′GTAGGATCCATATTATAGATATACCG?3′和含有SphI內(nèi)切酶位點的下游引物CWP2-4，序列為5′CAAGCATGCATGTTTTTTTC?3′以面包酵母基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到0.3kb?CWP2基因BamHI-SphI序列；

其中：PCR?的條件為：94℃?5分鐘；94℃?45秒，52℃?1分鐘，72℃?1分鐘，30個循環(huán)；72℃?10分鐘；

3c、將0.5kb?CWP2基因EcoRI-BamHI序列克隆到pGEM-T載體上；

3d、將0.3kb?CWP2基因BamHI-SphI序列克隆到步驟3c所得的載體上；

3e、用BamHI內(nèi)切酶從YDp-H上切下一段含有HIS3基因的?1.16kb片斷，將其插入步驟3d所得載體的BamHI多克隆位點處；

3f、用EcoRI–SphI酶切，得到cwp2Δ::?HIS3基因敲除組件；

（4）、構(gòu)建pdr5Δ::?LEU2基因敲除組件

4a、將含BglII內(nèi)切酶位點的上游引物?CWP2-1，序列為5′GTCAGATCTGTATTCCTAC?3′和下游引物CWP2-2，序列為5′CTGGAGATCTCCAATATTG?3′以面包酵母基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到1.5kb的PDR5基因；

其中：PCR?的條件為：94℃?5分鐘；94℃?45秒，52℃?1分鐘，72℃?1分鐘，30個循環(huán)；72℃?10分鐘；

4b、將PDR5基因克隆到pGEM-T載體上,用HindIII-BamHI內(nèi)切酶切下一段1.0kb的片斷，再加上BamHI接頭；

4c、用BamHI內(nèi)切酶從?YDp-L上切下一段含有LEU2基因的1.6kb片斷，接入BamHI接頭；

4d、用BglII酶切，得到pdr5Δ::?LEU2基因敲除組件；

（5）、將cwp1Δ::?hisG-URA3-hisG、cwp2Δ::?HIS3、?pdr5Δ::?LEU2基因敲除組件轉(zhuǎn)入snq2單基因敲除面包酵母，篩選得到cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除面包酵母；

5a、將snq2單基因敲除面包酵母接種到2毫升YPD培養(yǎng)液，30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘下振蕩培養(yǎng)16小時；

其中：YPD培養(yǎng)液的配方為：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，余者為水；

5b、再加入YPD培養(yǎng)液3毫升,?30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)4小時，得到snq2?單基因敲除面包酵母菌液；

5c、取1.5毫升snq2單基因敲除面包酵母菌液，以2500轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取沉淀物；

5d、將沉淀物懸于100毫摩/升的400微升醋酸鋰中，以2500轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取沉淀物；?

5e、將沉淀物懸于100毫摩/升的100微升醋酸鋰中；

5f、將2.0毫克/毫升的鮭魚精單鏈DNA?2微升煮沸5分鐘,冰浴后與cwp1Δ::?hisG-URA3-hisG、cwp2Δ::?HIS3、?pdr5Δ::?LEU2基因敲除組件各0.1～1微克一起加入到步驟5e的醋酸鋰中，室溫放置5分鐘；

5g、再加入280微升濃度為50%的聚乙二醇4000；

5h、振蕩至混勻，30℃靜置30分鐘；

5i、加入39微升二甲基亞砜，42℃熱激5分鐘；

5j、4000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取沉淀物，并將沉淀物懸于200微升無菌水中；

5k、4000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取沉淀物，懸于100微升無菌水中，涂SD-Leu-His?plus?5-FOA選擇性平板，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，生長出單克隆子，即為cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除面包酵母，也就是本發(fā)明的一種超高通透性面包酵母；

其中：SD-Leu-His?plus?5-FOA選擇性平板的配方為：酵母氮源無氨基酸無硫酸銨0.17?%，硫酸銨0.5%，葡萄糖2%，腺嘌呤0.2%，色氨酸1%，尿嘧啶1%，賴氨酸1%，瓊脂粉2%，余者為水；將配方中的物質(zhì)121℃高壓滅菌20分鐘，待溫度降到約50℃時，無菌條件下加入5-FOA?0.1%，即得SD-Leu-His?plus?5-FOA選擇性平板。