[發明專利]一種體外評價甲型H1N1流感病毒抗體效價的檢測方法的建立及應用

無效

• 申請號: 200910272207.3
• 申請日: 2009-09-25
• 公開（公告）號: CN101710119A
• 公開（公告）日: 2010-05-19
• 發明（設計）人: 華權高;沈鶴霄
• 申請（專利權）人: 武漢華美生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于人畜共患病研究領域，涉及一種人畜共患病的鑒別診斷方法。選擇了公開的甲型H1N1加利福尼亞病毒株(A/California/08/2009(H1N1))cDNA序列中HA基因為研究內容，首先根據結構生物學軟件分析出HA蛋白漏在包膜外部分的序列，再根據抗原性分析，選出免疫原性比較高的部分，通過基因合成方法獲得基因片段構建原核表達載體pGEX-6P-1-HA；將陽性重組質粒轉化到大腸桿菌中得到重組菌株(Escherichia?coli?BL21rosseta/pGEX-6P-1-HA截短蛋白)；通過多種層析方法獲得純化后的H1N1的HA截短蛋白，并利用所述的表達蛋白建立酶聯免疫吸附試驗間接法實驗原理評價病人體內因為流感病毒感染或疫苗免疫產生的抗體效價。

本發明提供重組強致病性的甲型H1N1流感病毒HA重要抗原表位蛋白的表達與純化方法以及用該蛋白建立的H1N1抗體的診斷方法。

背景技術

甲型H1N1流感是一種由A型豬流感病毒引起的豬呼吸系統疾病，該病毒可在豬群中造成流感暴發。2009年3月底至4月中旬，墨西哥、美國等多國接連暴發甲型H1N1型流感疫情，接著在短短的幾個月時間在全世界迅速蔓延。此次引發疫情的病毒是豬流感病毒A(H1N1)亞型，是一種從未在人和豬身上出現過的新型豬流感病毒。截止2009年9月3日，全球188個國家和地區發生了疫情，共報告25萬病例，累計死亡病例2800多例，實際上發病人數要遠遠超過報告的病例數。目前，北半球進入秋季，疫情呈快速上升趨勢。從我國內地來看，近期疫情形勢也發生了一些新的變化，疫情從沿海向全國、從城市向農村擴散，由輸入為主變為本土為主，由散發病例向聚集疫情發展。目前，內地31個省份都發現疫情，每日報告病例數呈上升趨勢，近期還陸續出現了重癥病例。我們面臨的疫情防控形勢不容樂觀。截至9月10日，我國內地31個省份累計報告甲型H1N1流感確診病例6968例。

甲型H1N1流感的潛伏期，較普通流感、禽流感潛伏期長，潛伏期時長七天。早期癥狀與普通人流感相似，包括發熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛等，有些還會出現腹瀉或嘔吐、肌肉痛或疲倦、眼睛發紅等癥狀。部分患者病情可迅速進展，來勢兇猛、突然高熱、體溫超過39℃，甚至繼發嚴重肺炎、急性呼吸窘迫綜合癥、肺出血、胸腔積液、全身血細胞減少、腎功能衰竭、敗血癥、休克及Reye綜合癥、呼吸衰竭及多器官損傷，導致死亡。甲型H1N1流感的蔓延給人群健康和經濟社會發展帶來巨大危害。疫情暴發后，我國高度重視防治防控工作，果斷決策，統一部署，采取了一系列有序有效的防控措施。秋冬季節，甲型H1N1流感會進入一個高峰期。學校開學成為聚集性發病的重要風險因素。所以，我國防控甲型H1NI流感形勢嚴峻。日前，國務院對秋冬季節我國甲型H1NI流感防控工作做出了一系列重要部署。下一階段的防控方針是：強化預防措施，嚴控社區傳播，加強重癥救治，全力減少疫情危害。所謂“社區”，重點包括學校、醫院等。我國將完善信息發布機制，制定針對人員密集流動情況下的鐵路、民航防控預案。同時，充分發揮疫苗手段，特別是在參加國慶游行的人員中首先啟動疫苗接種。中國首批甲型H1N1流感疫苗6月22日正式下線，在經過一系列生物、生化實驗和臨床實驗后，這批疫苗有望于9月上市。預計在國慶之前將產出滿足500萬人份的用量，并將全部用于國家儲備。目前，我國已成為世界上第一個可以應用甲型H1N1流感疫苗的國家。

全國范圍內的疫苗接種工作正在緊鑼密鼓的展開，但一些質疑也隨之而來。這些質疑主要針對甲流疫苗“一針免疫”是否能達到真正免疫的效果，免疫的持久性等方面。在2009年9月8日召開的新聞發布會上，國家食品藥品監督管理局藥品注冊司司長張偉回應有關甲流疫苗“一針免疫”的質疑時表示，目前只是暫定接種一針。甲流疫苗接種一針到底夠不夠，能不能產生有效的抗體？免疫的持久性如何？廣大民眾任然會有這樣的擔心。有沒有一種快速，簡便的方法對疫苗免疫效果作出精準的評估？

本公司所研制的試劑盒能夠快速、準確、廉價的檢測抗體效價，有效的解決了這一難題。

發明內容

其中所述的重組蛋白的制備方法，它包括下列步驟：

1)公開的甲型H1N1加利福尼亞病毒株(A/California/08/2009(H1N1))cDNA序列中HA基因為目的基因，通過基因合成的方法獲得基因片段；

2)在原核表達載體pGEX-6p-1多克隆位點中定向插入甲型H1N1流感病毒非結構蛋白基因HA截短蛋白的DNA序列，構建得到原核表達載體質粒pGEX-6p-1-HA截短蛋白基因；