[發明專利]一種分泌表達人Kallistatin的重組酵母菌株及生產工藝

無效

• 申請號: 200910263224.0
• 申請日: 2009-12-17
• 公開（公告）號: CN101724650A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 黃曉平;李招發;刁勇;許瑞安
• 申請（專利權）人: 刁勇;許瑞安
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C07K1/22;C07K1/20;C12R1/84
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技術領域

本發明涉及分子藥物學，生物技術和疾病防治，具體地說是采用酵母菌株生產人Kallistatin(Kal)的生產工藝，分泌表達載體的構建，發酵條件和純化方法。

背景技術

目前惡性腫瘤已經成為發達國家和地區居于前列的致死性疾病。雖然外科手術，放療和化療作為的常規治療手段仍在不斷發展，但由于其固有的局限，其療效已基本達到極限，因而迫切需要開發新的治療手段。

自從Folkman于1971年首次闡述腫瘤與新生血管依賴關系，并提出有關分子機制假說以來，以腫瘤新生血管為靶點的抗血管生成治療成為抗腫瘤研究的熱點。

Kal是一新型的具有抗血管生成作用的內源性蛋白(Miao?RQ，et?al.Blood2002；100：3245-52)，其抗血管生成作用與內皮抑素(endostatin)類似。內皮抑素通過其肝素結合活性介導其對血管生成的抑制作用。各種生長因子必須結合細胞表面兩種不同的受體，才能引發一個信號。硫酸肝素糖蛋白(HSPGs)是最普通的低吸附受體，在調節多種生長因子的作用時，發揮關鍵作用。許多生長因子，如VEGF和bFGF是肝素結合生長因子，VEGF和bFGF與內皮細胞表面的HSPGs結合，可以調節它們與專屬受體的結合。Kal是肝素結合蛋白，可以與VEGF和bFGF，以及其它含有肝素結合區的生長因子競爭結合HSPGs，因此阻斷了這些生長因子與HSPGs的結合，阻斷了這些生長因子引發的血管生成事件。另外，Kal還是絲氨酸蛋白酶抑制劑的一員，最初被認為是組織胰激肽原酶結合蛋白。越來越多的證據顯示，組織胰激肽原酶在腫瘤相關事件中非常重要，其中包括腫瘤生長調節，血管生成，侵入和轉移等。我們的研究發現，在Kal的作用下，HCC中作為細胞增殖的標志Ki-67染色降低，顯示Kal與組織胰激肽原酶的結合可能與HCC細胞增殖抑制有關。Kal可以從不同途徑抑制血管生成，因此是抗腫瘤血管生成治療的良好候選者。

已進行的Kal的抗腫瘤作用研究主要采用基因治療手段，而基因治療一般需要采用病毒載體，其長期應用的風險是各國衛生部門重點關注的問題，目前尚不明朗，很難在短期內實現上市并廣泛應用于腫瘤病人。而多種重組蛋白藥物已廣泛地應用于臨床，相關技術比較成熟，是開發基因重組藥物最常規的手段。所以本領域研究人員試圖建立一種高效生產Kal重組蛋白的方法，研究其蛋白形式對腫瘤的作用，為新型抗腫瘤藥物的開發奠定基礎。Kal的發現者Chao等曾采用大腸桿菌表達Kal重組蛋白，但表達量很低。本課題組也曾用大腸桿菌表達人Kal蛋白，表達水平也極低，且雜蛋白多難以純化。畢赤酵母表達系統是近年來建立起來的一種真核表達系統，已成功地表達了大量的重組蛋白，它既具有原核表達系統繁殖快、操作簡單的優點，同時又具有原核表達系統所沒有的優勢：如能對表達的目的蛋白進行正確加工、折疊及適度糖基化，分泌表達的雜蛋白少，易于分離純化等，因此越來越廣泛地用于重組蛋白的表達。國內外文獻尚未有利用畢赤酵母表達Kal蛋白的報道。本發明人利用畢赤酵母表達人Kal蛋白，發現采用常規的技術方法得到的重組菌株表達水平很低，難以大規模生產。純化工藝也比較復雜。現有市售酵母分泌型表達載體所用的信號肽幾乎全是α交配因子信號肽，重組蛋白的翻譯后加工需要兩種不同的酶參與，往往產生加工不均勻和不正確的現象，得到的重組蛋白的N端序列出現偏差。

發明內容

針對現有技術存在的問題和缺陷，本發明對市售的酵母分泌型表達載體pPIC9進行改造，并從發酵工藝和純化工藝等多個環節進行最佳條件的摸索和優化，得到了可以高效表達人Kal的分泌型表達酵母菌株，并建立了可以用于工業化生產的發酵工藝和純化工藝。

信號肽序列是分泌型酵母表達載體非常重要的表達元件，對于不同的目標蛋白，α交配因子信號肽往往不能有效、正確的轉位和加工，因而所得到的目標蛋白的N端序列經常不是天然序列。本發明對多種信號肽序列進行了篩選，從表達水平高低和N端序列正確與否等多個方面進行了研究，確定了本發明載體的關鍵元件構成。

本發明采用廉價的BMMY培養基即可成功地高水平分泌表達Kal蛋白。由于分泌的Kal蛋白成分水平高，下游純化非常方便，經兩步層析純度即可達到98％以上，非常便于工藝化生產。

附圖說明

圖1發酵上清液的Western?Blot分析。條帶1為酵母菌株GS115/p?PIC9的發酵上清液，無Kal的陽性反應；帶1為酵母菌株Kal02的發酵上清液，呈現Kal的陽性反應。箭頭所指為Kal蛋白。