[發明專利]一種提高發酵法生產PVA降解酶產量的方法

有效

• 申請號: 200910260992.0
• 申請日: 2009-12-18
• 公開（公告）號: CN101724609A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;唐波;張東旭
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N9/14
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種提高發酵法生產PVA降解酶產量的方法，屬于發酵工程領域，具體來說 是一種通過添加1，4-丁二醇提高發酵法生產PVA降解酶產量的方法。

背景技術

PVA降解酶是一個酶系，它們作用的共同效果是能降解PVA。目前已正式報道的PVA 降解酶主要包含三個種類：PVA氧化酶(仲醇氧化酶)(EC1.1.3.30)、PVA脫氫酶(EC1.1.99.23) 和氧化型PVA水解酶(β-雙酮水解酶)(EC3.7.1.7)。近年還發現了專一性比較高的降解低醇 解度PVA長鏈上殘存乙酸酯鍵的PVA酯酶。目前對于PVA降解的研究主要集中在三個方面： 1.篩選能夠降解PVA的微生物；2.純化PVA降解酶；3.克隆與PVA降解相關的基因。目前研 究中的一個難點是PVA降解酶的酶活較低。現在主要有兩種提高PVA降解酶產量的方法： 1.篩選高產PVA降解酶的微生物；2.優化發酵條件。在PVA降解酶高產微生物的基礎上，本 技術通過一種特殊碳源(1，4-丁二醇)顯著提高了PVA降解酶的產量，使其酶活水平達到了 國內先進。

發明內容

本發明所解決的技術問題是提供一種提高發酵法生產PVA降解酶產量的方法。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案如下：在微生物發酵生產PVA降解酶過程中， 添加1，4-丁二醇。

所述1，4-丁二醇的添加方式為：以5.0g/L?PVA和5.1g/L?1，4-丁二醇作為初始復合碳源。

所述1，4-丁二醇的添加方式為：以5.0g/L?PVA作為唯一初始碳源，在發酵36h添加5.1g/L 1，4-丁二醇；

所述1，4-丁二醇的添加方式為：以5.0g/L?PVA作為唯一初始碳源，在發酵36h添加5.1g/L 1，4-丁二醇，在發酵48h，添加5.0g/L?PVA。

所述微生物為從無錫太平洋紡織廠PVA退漿車間下水道口篩選出一個可以徹底降解培養 基中1g/L?PVA的混合微生物體系(Chen?J，Zhang?Y，Du?G-C，Hua?Z-Z，Zhu?Y， Biodegradation?of?polyvinyl?alcohol?by?a?mixed?microbial?culture，Enzyme?Microb.Technol.， 2007，40(7)，1686-1691)。

微生物發酵產PVA降解酶的培養基組成為：

基礎培養基(g/L)：PVA?1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)5.0，酵母粉2.0， K₂HPO₄?1.0，KH₂PO₄?0.125，MgSO₄·7H2O?0.1，FeSO₄·7H2O?0.05，CaCl₂?0.025，NaCl?0.01， pH?7.5，121℃滅菌15min；

微生物發酵產酶的過程為：

液體種子培養方法：500mL三角瓶裝50mL基礎培養基，接種后在旋轉式搖床上200 r/min，30℃振蕩培養36h；

兩步發酵法：第一步，500mL三角瓶裝50mL基礎培養基，接種后在旋轉式搖床上200 r/min，30℃振蕩培養；第二步，發酵36h添加5.1g/L?1，4-丁二醇；

三步發酵法：第一步，500mL三角瓶裝50mL基礎培養基，接種后在旋轉式搖床上200 r/min，30℃振蕩培養；第二步，發酵36h添加5.1g/L?1，4-丁二醇；第三步，發酵48h添加 5.0g/L?PVA。

PVA含量測定采用Finley法，其具體方法為：

將發酵液離心(10000r/min，10min)，棄去沉淀，收集上清液。將上清液經微孔濾膜(孔 徑0.45μm，直徑50mm)過濾，然后用0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH?8.0)透析24h，即為粗酶液。 在5×15試管中加入0.5mL粗酶液和0.5mL底物(1g/L?PVA1799溶于pH?8.0的磷酸鉀緩沖液 中)，將此混合體系于35℃反應6h，分別測定反應前后反應混合液所對應PVA含量的吸光度。 每分鐘吸光度下降0.001定義為一個酶活單位。

細胞干重測定方法為：