[發明專利]恩拉霉素新產生菌及其高產突變株

無效

• 申請號: 200910253869.6
• 申請日: 2009-12-01
• 公開（公告）號: CN102080056A
• 公開（公告）日: 2011-06-01
• 發明（設計）人: 徐俊;肖靜;馬光輝
• 申請（專利權）人: 國家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P21/04;C12R1/645
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭

技術領域：

本發明涉及一種生物醫藥技術領域的肽類抗生素產生菌，特別是恩拉霉素新產生菌及其高產突變株。

背景技術：

恩拉霉素，又名恩來霉素、恩霉素、安來霉素、持久霉素，是由土壤放線菌Streptomyces?fungicidious?ATCC?21013發酵產生的一種多肽類抗生素。該藥于1966年由日本武田藥品工業株式會社研發，1974年在日本正式注冊，其后在許多國家被注冊和廣泛使用。該技術后被美國先靈葆雅動物保健品有限公司收購，并用于生產飼料預混劑。

恩拉霉素對梭狀芽孢桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、肺炎雙球菌等革蘭氏陽性菌具有強大的抗菌活性和優良的促生長及改善飼料利用率的作用，常作為禽、豬、魚的抗生素促生長劑。恩拉霉素具有很高的穩定性，在制成顆粒料過程及與飼料混合后在室溫下長期儲藏效價下降甚微。恩拉霉素在腸道內不被降解，能夠保持原有的抗菌活性。未吸收抗生素主要隨糞便排出體外，故口服恩拉霉素藥物殘留很少。恩拉霉素為肽類抗生素，其排放到環境中，容易被環境微生物所降解，從而對環境的污染程度小。實踐證明恩拉霉素是一種優良的獸用抗生素，具有用量低、低殘留、不易產生抗藥性及環境友好等特點。

恩拉霉素為十七個氨基酸縮合的環肽，依據其連接的脂肪酸側鏈的長度不同可分為A、B兩個不同組分。對Streptomyces?fungicidious?ATCC?21013的研究表明，恩拉霉素生物合成基因簇包括四個非核糖體肽合酶(NRPS)基因及其它相關基因。

本發明根據非核糖體肽合酶的保守區域設計引物對海洋來源的鏈霉菌進行篩選，從中發現一株暗黑微綠鏈霉菌具有恩拉霉素生物合成相關的NRPS基因。對該鏈霉菌的發酵產物的HPLC分析表明該菌株可產生恩拉霉素。后對原始菌株通過抗性誘變選育，獲得了產量提高的可用于工業生產的恩拉霉素的新菌株。

發明內容：

本發明的目的在于提供一株通過基因篩選方法獲得的恩拉霉素新產生菌，該菌株為暗黑微綠鏈霉菌(Streptomyces?atrovirens)，2009年10月23日保藏于位于北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：CGMCC?No.3365。

本發明的另一目的在于提供一種前述恩拉霉素產生菌的突變菌株，該突變菌株通過核糖體工程選育，且其產量比原始菌株提高70％。該突變菌株為暗黑微綠鏈霉菌(Streptomyces?atrovirens)，2009年10月23日保藏于位于北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：CGMCC?No.3367。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明涉及從海洋來源的鏈霉菌中篩選得到產生肽類抗生素恩拉霉素的菌株，該方法具體為：

步驟一，提取待選鏈霉菌的基因組DNA；

步驟二，用針對非核糖體肽類合成酶設計的兼并引物對待選菌株基因組DNA進行PCR擴增；

步驟三，將陽性擴增的片段進行測序，并提交數據庫進行比對，獲得與已知化合物恩拉霉素產生菌Streptomyces?fungicidicus的氨基酸序列相似性為96％的序列，其同源性比較見圖1.

步驟四，對菌株進行發酵、有機溶劑萃取、HPLC分析，同時與恩拉霉素標準樣品進行比較，確定菌株產恩拉霉素的能力(見附圖3)；

步驟五，測定菌株16S?rDNA序列，確定菌株的分類地位；

獲得菌株CGMCC?NO.3365的16S?rDNA基因片段1487bp(SEQ?ID?NO?1)，提交EzTaxon數據庫進行比較，其與已知鏈霉菌Streptomyces?atrovirens?NRRL?B-16357的相似性為99.6％。確定菌株為暗黑微綠鏈霉菌(Streptomyces?atrovirens)。

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