[發明專利]大白菜PHK4蛋白編碼序列及其功能驗證

無效

• 申請號: 200910248966.6
• 申請日: 2009-12-29
• 公開（公告）號: CN102108345A
• 公開（公告）日: 2011-06-29
• 發明（設計）人: 王火旭;鄭萍;李丹;梁丹;任相亮
• 申請（專利權）人: 遼寧師范大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12N5/10;C12R1/19;C12R1/01
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技術領域：

本發明屬于分子生物學和基因工程領域。具體涉及到大白菜PHK4蛋白的編碼序列及其功能驗證。

背景技術：

在高等植物中，細胞分裂素廣泛參與了對植物生長發育的調控，包括參與配子細胞與胚胎發育；促進芽的分化；調控頂端優勢、抑制主根的伸長；促進維管束的形成、花和果實的發育；參與脅迫反應和病原抵抗以及延緩開花時間和葉片衰老等。

細胞分裂素的調控作用是通過信號網絡實現的。細胞分裂素受體負責細胞分裂素信號的感應和轉導，是信號傳遞的起始點。

大白菜是一種重要的蔬菜作物。分離大白菜的細胞分裂素受體基因，將為利用基因工程手段調控大白菜的株型、單株重、生育期、根系發育，提高大白菜耐生物/非生物脅迫能力奠定重要基礎。

目前已公布的大白菜基因組測序結果尚不完整，大白菜細胞分裂素受體PHK4(pekinensis?histidin?kinase4)蛋白的編碼序列至今在國內外未見報道。

發明內容：

本發明公開了大白菜細胞分裂素受體PHK4蛋白質的氨基酸序列以及該蛋白的編碼基因的核苷酸序列及其功能驗證。

本發明解決技術問題所采用的技術方案是：

本發明分離出了多核苷酸，其序列特征是：序列全長3156bp，編號為SEQ?ID?NO：1。該分子含有大白菜細胞分裂素受體PHK4蛋白的編碼序列。

本發明提供的蛋白質多肽，其特征是：具有SEQ?IDNO：2氨基酸序列。

本發明提供了包含上述多核苷酸的載體。

本發明提供了一種上述載體轉化或轉導的宿主細胞，在實例中該宿主細胞是大腸桿菌感受態細胞、農桿菌感受態細胞、酵母Δsln1突變體和擬南芥ahk4-1突變體。

本發明提供了一種利用轉基因技術將PHK4基因轉化入酵母突變體Δsln1和擬南芥ahk4-1突變體來驗證PHK4具有細胞分裂素受體功能的方法。

具體實施方式：

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。

實施例1

大白菜細胞分裂素受體PHK4的基因組編碼序列的分離

用已知的十字花科植物細胞分裂素受體基因cDNA序列，通過比較，得到相似性較高的一段大白菜的EST序列，在其上設計引物進行反向PCR擴增，得到該EST序列兩側未知序列，通過染色體步移技術進一步向一端延伸，擴增出3’端未知序列，再通過與基因序列庫的比對分析，尋找基因相似性較高的序列，在其上設計引物，通過常規PCR擴增獲得5’端序列，拼接后獲得一段全長為8474bp的DNA序列。該序列包含PHK4蛋白的基因組編碼序列。

詳細過程如下：

1、植物基因組DNA的環化

提取植物基因組DNA，利用限制性內切酶對基因組DNA進行酶切，然后通過T4DNA?Ligase使酶切片段進行自身環化。

2、反向PCR

設計反向PCR引物，引物序列為：

P1：5’-GGATATTCAAATGCCACAG-3’(SEQ?ID?NO：3)

P2：5’-ATGAAGCAAGCATCGAAAG-3’(SEQ?ID?NO：4)

以環化DNA作為模板，以P1，P2作為引物進行反向PCR擴增，對擴增產物進行嵌套PCR，嵌套PCR擴增引物為：

P3：GATTCTAGCCATGACAGC(SEQ?ID?NO：5)

P4：TGTTGGAGGTGTCGTGCTT(SEQ?ID?NO：6)

回收擴增產物，連接到pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒，測序，與已知片段重復序列拼接。以此片段再次設計反向PCR引物，引物序列為：

P5：CATGGGAGACTTAGACGTGG(SEQ?ID?NO：7)

P6：CTCGAAGTGGAGCTATCCGC(SEQ?ID?NO：8)

進行反向PCR擴增，回收擴增產物，連接到pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒，測序，將測序結果的重疊區拼接，獲得了長度為3249bp的DNA片段。比對分析結果表明該序列包括PHK4基因完整3’端。

3、染色體步移

在3249bp片段的5’端設計三條特異性嵌套引物，引物序列為：

P-SP1：TTTGGAAGCGGCGGTTATGTCT(SEQ?ID?NO：9)