[發明專利]具有多種活性作用的海膽共附生菌株的分離純化方法

無效

• 申請號: 200910248961.3
• 申請日: 2009-12-29
• 公開（公告）號: CN101735970A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發明（設計）人: 張付云
• 申請（專利權）人: 大連水產學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01P1/00;A01P3/00;A61P39/06;A61P31/04;A61P17/02;C12R1/01
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 曲寶威

技術領域

本發明涉及一種菌株的分離純化方法，特別是一種具有多種活性作用的海膽共附生菌株的分離純化方法。

背景技術

海膽(echinus)是一種棘皮動物，長著一個圓圓的石灰質硬殼，全身長滿硬刺，形狀有心形、半球形、盤形等，殼直徑一般為6～10cm，大者達30～40cm。大都生活在淺海巖礁底或石縫中，有背光和晝伏夜出習性，主要以海藻類和小動物等為食。因海膽全身長滿可動的棘刺，故有“海刺猬”之稱。海膽種類較多，據記載，全球共有850多種，主要食用品種有：紫海膽、心形海膽，主要養殖品種有：紫海膽、馬糞海膽。海膽的營養價值很高，其體內的生殖腺，稱為海膽卵，又稱海膽黃、海膽膏。海膽卵有生殖和儲存營養的作用，又是種特殊風味的美食，是海洋食品中名貴的珍品。海膽卵不僅味美而且營養豐富，蛋白質含量15.8％，脂肪含量為8.5％，糖類含量為2.2％還有多糖、磷脂、維生素、氨基酸和礦物質等等。

海膽不但具有較高的食用價值，同時還有極好的藥用功能，尤其對心血管疾病有較好的防治效果。中醫認為，海膽黃有強精、壯陽、益心、強骨、補血的功效。海膽具有化痰消腫，治療白血病，抗腫瘤，雄性激素樣，毒性作用等功效。而海洋動植物共附生的微生物提高了宿主在海洋中的生存能力和適應能力，產生了抑制競爭關系生物體的生長。如抗生素、多糖、酶等都是其中產生的。人們對從海洋環境中極其多樣性的微生物中開發新的特效藥寄予極大的希望。

發明內容

本發明的目的是提供一種步驟簡單、好操作、易控制的具有多種活性作用的海膽共附生菌株的分離純化方法，為該菌株的發酵產物在藥品、生物農藥和食品保鮮、防腐劑和化妝品的添加劑方面的開發利用提供方便。

本發明的具有多種活性作用的海膽共附生菌株的分離純化方法，其特征在于：取一個海膽用無菌海水沖洗干凈，研磨碎后加入無菌水，靜置沉淀，取上清液滴加在牛肉膏蛋白胨海水固體培養基上，用三角棒涂布均勻，在37℃下培養2天，在原培養基上挑取單個形態各異的菌落，在牛肉膏蛋白胨海水固體培養基上劃線培養，重復上述步驟，直到有純菌株出現為止并編號，移入斜面和液體牛肉膏蛋白胨培養基中培養1天，冰箱保存備用。

本發明的具有多種活性作用的海膽共附生菌株的分離純化方法，具有工藝步驟簡單、好操作、易控制的優點，本方法分離的純菌株的發酵產物在藥品、生物農藥和食品保鮮、防腐劑和化妝品的添加劑方面的開發利用提供方便。

具體實施方式

取一個海膽用無菌海水沖洗3次后，用剪刀剪片研磨碎后加入少量無菌水，靜置沉淀，取上清液滴加在牛肉膏蛋白胨海水培養基上，用三角棒涂布均勻，作三個重復。37℃下培養2天，根據觀察結果，在原培養基上挑取單個形態不一樣菌落，再次在牛肉膏蛋白胨培養基上劃線培養，之后觀察生長情況。重復以上步驟，直到有純菌株出現為止并編號。移入斜面和液體牛肉膏蛋白胨培養基中培養1天，冰箱保存備用，應用生理生化方法對該活性菌株鑒定，結果屬于鹽桿菌屬。

濾紙片法檢測抑菌活性，鄰苯三酚法檢測超氧陰離子自由基(O^2-)清除作用，Fenton法檢測羥自由基(·OH)清除作用，大豆子葉法測定植物誘抗活性。結果表明該菌株的發酵產物可以作為治療和預防清除體內過氧化物的藥物或保健食品，能與輔料混合形成各種形式的丸劑、散劑、片劑、膏劑，粉劑、水劑，顆粒劑、膠囊等；可以作為治療皮膚表淺創傷的藥物或應用于化妝品的添加劑，在使用時可以采取經涂抹或非噴施的給藥方式，使用可以任意選用生理鹽水，穩定劑，懸浮劑或乳化劑等；可以作為誘導植物抗性的生物農藥，農藥形態可以是液體也可以是粉劑；可以作為食品防腐劑、保鮮劑和抗氧化劑應用于食品領域。

具體實例如下：

實例1

取一個海膽用無菌海水沖洗3次后，用剪刀剪片研磨碎后加入少量無菌水，靜置沉淀，取上清液滴加在牛肉膏蛋白胨海水培養基上，用三角棒涂布均勻，作三個重復。37℃下培養2天，根據觀察結果，在原培養基上挑取單個形態不一樣菌落，再次在牛肉膏蛋白胨培養基上劃線培養，之后觀察生長情況。重復以上步驟，直到菌株純化。純化的菌株接入液體牛肉膏蛋白胨培養基，37℃培養一天，發酵產物用除菌濾膜過濾，冰箱保存用于檢測活性。

實例2