[發明專利]一種FGFR1高表達的重組HEK293細胞及其應用

無效

• 申請號: 200910246588.8
• 申請日: 2009-11-27
• 公開（公告）號: CN101875916A
• 公開（公告）日: 2010-11-03
• 發明（設計）人: 賀浪沖;周亞麗;張彥民;羅文娟;李淼;孫萌
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及FGFR高表達的非癌細胞的構建，特別涉及一種基于外源重組質粒的FGFR1高表達的重組HEK293細胞及其應用。

技術背景

酪氨酸激酶受體(RTK)是一個龐大的家族，在生物體的生命活動中擔當著非常重要的作用。當配體與RTK結合后，能誘導受體構象變化，導致受體發生穩定的二聚化，二聚化的受體相互交叉磷酸化，在受體激酶區內形成含有磷酸化酪氨酸位點的基序，并伴有PTK的激活。酪氨酸特異的磷酸化使激酶區穩定在激活的構象，并為下游含有src癌基因家族SH2區和結合磷酸化酪氨酸的功能區(phosphotyrosine?binding?domain，PTB)的信號轉導分子提供識別、停靠和結合的部位。這些信號轉導蛋白又可進一步募集含有SH2、PTB、SH3以及PH區的其他一些效應蛋白，在膜上組裝成激活的信號轉導的復合物，通過啟動細胞內的信號通路(如PLC?γ-DAG-PKC與IP3-Ca2+釋放、PI-3K-PKB通路、Ras-Raf-MAPK通路等)調節細胞的生長、分化、運動、變形和代謝等，導致多種效應。

成纖維生長因子受體(fibroblastgrowthfactorreceptor，FGFR)屬于酪氨酸激酶受體家族中的一類，目前已確定有4種獨立基因分別編碼FGFR1-FGFR4。與其它的酪氨酸激酶受體一樣，FGFR1-FGFR4都由三個結構域組成：胞外配體結合結構域，單鏈跨膜結構域及胞槳區。酪氨酸激酶受體FGFR通過FGFR轉錄本的選擇性剪切產生很多FGFR亞型，各亞型具有組織特異性和配體結合特異性。

不同亞型的FGFR胞外區含有2-3個Ig樣結構域，被定義為D1-D3結構域；也分別稱為Loop?I、II、III，配體的特異性由LoopIII決定。在D1和D2的連接處有7-8個酸性氨基酸殘基組成的“酸性盒”，是所有FGFRs都具有的保守結構，與FGFR的功能有關。在D2區有與肝素硫酸鹽蛋白結合的保守序列，具有活性的堿性成纖維生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)可以選擇性地與載體蛋白肝素硫酸鹽蛋白多糖(HSPG)發生可逆性結合，這種載體蛋白能夠將bFGF從胞外儲蓄區轉運到細胞膜受體FGFR上，并且防止bFGF在這一過程中被降解或失活。D3區也有重要的生物學功能，可溶性的分泌型FGFR可以選擇性剪切D3結構域，剪切后的結構域能夠改變它與配體結合的特性(Cytokine?&?Growth?factor?reviews，2005，16(2)：139-149)。

bFGFs/FGFR激活的信號轉導途徑主要包括以下幾種：(1)PKC路徑。FGFR被激活后，它不斷地與磷酸脂酶C?γ(PLC-γ)分子上的SH2結構域結合來快速吸納該分子，激活的PLC-γ水解其底物4，5-二磷酸磷脂酰肌醇，形成二酰基甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)2個信號分子。IP3通過與細胞內特異受體結合而刺激細胞內的鈣池釋放Ca²⁺/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶。此外，Ca2+與二酰基甘油都能激活蛋白激酶C。由PIP水解產生的二級信號除了磷酸化和激活轉錄因子外，還激活了多種細胞內的反應(Cell，2000，103(2)：211-225)。(2)Ras/Raf/MAP。FGF與FGFR結合后，使Gab1發生磷酸化，磷酸化的Gab1與Grb2的SH3結構域結合，形成復合物。同時，Grb2/FRS2復合物促使磷酸化的Gab1募集含有SH2結構域的信號蛋白分子，包括Sos，Ras，Raf。Raf蛋白磷酸化后引起MAPKK信號通路發生級連放大效應(Cytokine?&?Growth?Factor?Reviews，2000，11(4)：295-302)。(3)JAK/STAT途徑。FGF與FGFR結合后，FGFR的自身磷酸化使JAK活化，活化的JAKs使受體磷酸化，再活化信號轉導子和轉錄活化子蛋白(STAT)，STAT蛋白能使C端保存的酪氨酸殘基磷酸化。STATs被磷酸化后即脫離它所在的受體形成穩定的同源或異源的二聚體式并定位于細胞核，與γ干擾素激活部位(GAS)增強子家族成員結合并激活靶基因的轉錄(國際病理科學與臨床雜志，2007，27(2)：125-129)。