[發(fā)明專利]一種KDR高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910246576.5
• 申請日: 2009-11-27
• 公開（公告）號: CN101701209A
• 公開（公告）日: 2010-05-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李旭;葛曉雯;賀浪沖;王嗣岑;杜暉;張彥民
• 申請（專利權(quán)）人: 西安交通大學(xué)
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及血管內(nèi)皮生長因子高表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建，特別涉及一種基于外源重組質(zhì)粒的KDR高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞及其應(yīng)用。?

技術(shù)背景

血管生成(angiogenesis)是指在原有血管床的基礎(chǔ)上再生成新的血管，是一個復(fù)雜的受多因素調(diào)控的過程。正常生理情況下的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)對血管生成起著關(guān)鍵的作用，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的刺激血管生成的因子之一。VEGF是通過與其受體結(jié)合從而發(fā)揮刺激血管生成的生物學(xué)效應(yīng)的。?

VEGF受體分子由7個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)形成的胞外部分、含有酪氨酸激酶的胞內(nèi)部分及跨膜區(qū)域三部分構(gòu)成。其中胞內(nèi)部分含有的一段酪氨酸插入序列，是磷酸化下游信號分子的結(jié)合位點。VEGF的受體包括fms樣酪氨酸激酶受體VEGFR-1，即FLT-1(Fms-like?tyrosine)，胎兒肝激酶插入?yún)^(qū)受體VEGFR-2，即FLK-1(Kinase?insert?domain-containing?receptor)、KDR(Kinase?insertdomain-containing?receptor，KDR)、VEGFR-3和Neuropilin-1(NRP-1)。?

VEGF和VEGFR結(jié)合后最主要的生物學(xué)效應(yīng)是促使內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，從而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖，進(jìn)一步促使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生遷移，同時增強(qiáng)毛細(xì)血管通透性，使血漿外滲，有利于新生血管以出芽的方式生成，最終致大量新生血管形成。?

血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2，KDR)是介導(dǎo)腫瘤新生血管形成的主要受體。有研究提示KDR與內(nèi)皮細(xì)胞對VEGF的增生反應(yīng)有關(guān)。還有研究表明阻斷VEGF與KDR的相互作用能夠抑制動物體內(nèi)實體瘤的生長，從而達(dá)到治療腫瘤的目的(Curr?Top?Microbiol?Immunol，1999；237：1-30；Cell，1998，?92：735-745。)。以KDR為靶點進(jìn)行腫瘤的相關(guān)研究逐漸成為當(dāng)今腫瘤研究的一個新熱點。因此，能夠高豐度表達(dá)KDR蛋白的細(xì)胞系將有著廣泛的應(yīng)用前景，可以作為細(xì)胞模型研究不同微環(huán)境對KDR發(fā)揮作用及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，還能用其篩選有效的抗腫瘤血管生成的藥物等。?

之前的研究者往往利用相對高表達(dá)KDR的血管內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對象，但其具有以下缺陷：1、細(xì)胞生長慢；2、細(xì)胞培養(yǎng)要求高；3、細(xì)胞培養(yǎng)成本高；4、細(xì)胞表面KDR表達(dá)豐度達(dá)不到要求。而且，目前已有的穩(wěn)定高表達(dá)KDR的細(xì)胞株所攜帶的KDR基因均不是全長KDR基因，影響了KDR發(fā)揮完整的功能。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的問題在于提供一種KDR高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞，在構(gòu)建KDR全長基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-KDR的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得穩(wěn)定、高表達(dá)KDR分子的重組HEK293細(xì)胞株。?

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：?

一種KDR高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞，該重組細(xì)胞是以HEK293細(xì)胞為宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的外源性表達(dá)載體是包含KDR全長基因的表達(dá)載體。?

所述的KDR全長基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。?

所述的包含KDR全長基因的表達(dá)載體是pcDNA3.1(+)-KDR，該表達(dá)載體是通過KpnI和XbaI酶切位點將KDR全長基因克隆入真核質(zhì)粒pcDNA3.1(+)。?

所述的KDR高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞應(yīng)用于以血管內(nèi)皮生長因子受體為靶點的藥物篩選。?

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：?

1、本發(fā)明構(gòu)建了包含血管內(nèi)皮生長因子受體2(KDR)基因全長的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-KDR，基因測序結(jié)果與基因庫人KDR一致；pcDNA3.1(+)-KDR載體脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)過篩選獲得了獲得穩(wěn)定、高表達(dá)KDR分子的重組HEK293-KDR細(xì)胞株；?

本發(fā)明構(gòu)建的重組細(xì)胞生長速度快，包含KDR基因全長的重組HEK293-KDR細(xì)胞在相同條件下生長速度顯著超過HEK293；?

與現(xiàn)有只含KDR胞外區(qū)或部分基因序列構(gòu)建的重組細(xì)胞相比，本發(fā)明構(gòu)建的包含KDR基因全長的重組HEK293-KDR細(xì)胞株表面能夠穩(wěn)定的表達(dá)KDR分子，而且具有完整的分子活性。?