[發明專利]一種快速檢測牛羊源成分的方法

無效

• 申請號: 200910245030.8
• 申請日: 2009-12-23
• 公開（公告）號: CN101724701A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 朱珠;王永;蘭青闊;趙新;程奕
• 申請（專利權）人: 天津市農業科學院中心實驗室
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及動物源性成分的快速檢測方法，更具體的說 是一種快速檢測牛羊源成分的方法，通過肉眼觀察反應管濁度或觀察加入1000×SYBR Green后顏色變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳來判斷擴增情況。

背景技術

瘋牛病(Mad?COW?disease)最早在1985年英國的阿什福特農場出現“可疑病例”， 1986年11月研究人員對病牛做了病理組織學檢查，發現腦組織產生許多海綿樣小孔， 定名為牛海綿狀腦病(Bovine?spongiform?encephalopathy，BSE)，并確診此病為牛的 一種新病，1987年由Wells等首次報道。瘋牛病的流行給世界養牛業、飼料工業、牛 肉及其產品都造成了嚴重影響和損失，同時此病也嚴重地威脅著人類的生命和健康。

BSE的病原為朊病毒，癢病和瘋牛病的共同特征是潛伏期長，具有傳染性的致死性 中樞神經系統疾病，包括人的震顫病，雅克氏病等等。朊病毒又非常類似于健康細胞， 很難被抗體識別，感染后不刺激機體產生免疫反應，所以，對它的檢測很困難。尚無法 分離病原，因此無法用血清學方法檢測抗體，也無法檢測活體是否感染。因此，BSE只 能依靠流行病學、臨床癥狀、中樞神經系統病理組織學變化進行診斷，同時輔助以電鏡 技術、生化技術或免疫細胞化學法等做出綜合診斷。世界各國都在尋找快速檢測和殺滅 BSE病原的方法，但目前尚無治療和預防的藥物。目前，普遍認為瘋牛病的大規模爆發， 其主要原因是牛食用了含有羊癢病朊病毒的肉骨粉所致。瘋牛病的發生和蔓延已給歐盟 國家養牛業和經濟帶來重大損失，而且感染人，危害人體健康，引發社會動蕩。為此， 英國自1988年起就禁止使用反芻動物飼料飼喂牛，隨后世界上許多國家和地區都先后 頒布了法律、法規以控制動物源性成分的使用。鑒于該病的主要傳播途徑是使用被瘋牛 病和綿羊癢病病原因子污染的肉骨粉等動物性飼料飼喂反芻動物，為了徹底切斷瘋牛病 的傳播途徑，防止瘋牛病在我國境內發生，我國也發布了關于禁止在反芻動物飼料中添 加和使用動物性飼料的通知。禁止在反芻動物飼料中添加和使用動物性飼料產品：肉骨 粉、骨粉、血粉、血漿粉、動物下腳料、動物脂肪、干血漿及其他血液制品、脫水蛋白、 蹄粉、角粉、雞雜碎粉、羽毛粉、油渣、魚粉、骨膠等。

目前，動物源性成分(動物性飼料產品)鑒定的主要方法有物理、化學、免疫學和 分子生物學等方法，其中尤以分子生物學方法最為快速、靈敏。關于定性PCR、復合PCR、 巢式PCR及實時熒光定量PCR的檢測方法都有所報道。但采用牛源正向外引物COW-F3， 牛源反向外引物COW-B3，牛源正向內引物COW-FIP，牛源反向內引物COW-BIP；羊源正 向外引物SHEEP-F3，羊源反向外引物SHEEP-B3，羊源正向內引物SHEEP-FIP，羊源反 向內引物SHEEP-BIP恒溫擴增檢測牛羊源成分的方法，尚未見文獻報道。

發明內容

本發明的目的在于公開一種快速檢測動物源性成分特別是牛羊源成分的方法及根 據外源基因與內源基因接合處序列設計一套引物對其進行擴增，通過肉眼觀察濁度或觀 察加入SYBR?Green后顏色的變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳結果判斷擴增情況。本發明采用 新型、高效、高靈敏度、高特異性的恒溫擴增方法，能在一個小時內準確檢測出樣品中 是否含有動物源性成分，特別是準確檢測出樣品中是否含有牛羊源性成分。為實現上述 目的，本發明公開了如下的技術方案：

兩套用于檢測牛羊源成分的特異性引物，其特征在于，包括牛源正向外引物 COW-F3，牛源反向外引物COW-B3，牛源正向內引物COW-FIP，牛源反向內引物COW-BIP； 羊源正向外引物SHEEP-F3，羊源反向外引物SHEEP-B3，羊源正向內引物SHEEP-FIP， 羊源反向內引物SHEEP-BIP。序列見下表：