[發(fā)明專利]一種枯草芽孢桿菌的混菌協(xié)同發(fā)酵工藝

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910241894.2
• 申請日: 2009-12-14
• 公開（公告）號: CN101717723A
• 公開（公告）日: 2010-06-02
• 發(fā)明（設計）人: 李春;武占省;趙雅峰;陶晶;李艷菊
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 北京理工大學專利中心 11120
• 代理人: 楊志兵;張利萍

1.一種枯草芽孢桿菌的混菌協(xié)同發(fā)酵方法，其特征在于：選取三株不同類型枯草芽孢桿 菌：保藏號為CGMCC?NO.0954的枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）B9601-Y2、保藏號為 CGMCC?No.1019的枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）NCD-2和保藏號為CGMCC?No.2099 枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）BAB-1，采用混合發(fā)酵工藝，通過對所述三株菌株的適宜培 養(yǎng)基選擇，混菌發(fā)酵工藝參數(shù)：pH值、溫度、通氣量及三株菌的接種量比例的控制，能夠穩(wěn) 定的獲得枯草芽孢桿菌組合的發(fā)酵液，其中有益微生物的有效活菌數(shù)≥10¹²cfu/ml。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌的混菌協(xié)同發(fā)酵方法，其特征在于：發(fā)酵工 藝包括以下步驟：

步驟一、種子活化

將三種發(fā)酵菌株：Bacillus?subtilis?B9601-Y2、Bacillus?subtilis?NCD-2和Bacillus?subtilis? BAB-1分開培養(yǎng)，分別劃線于種子活化培養(yǎng)基試管斜面上，在28~30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h， 得到供三種生產(chǎn)用的斜面菌種；

步驟二、一級種子液制備

將步驟一中所述的三種斜面菌種分開培養(yǎng)，用接種環(huán)分別挑取所述斜面菌種單菌落，接 種于裝有一級種子培養(yǎng)基的三角瓶中，進行搖瓶培養(yǎng)，一級種子培養(yǎng)基的裝液量為三角瓶體 積的20~30%，在28~30℃下180~200r/min振蕩培養(yǎng)18~24h，得到所述三種發(fā)酵菌株的一級 種子液；

步驟三、二級種子液制備

將所述三種一級種子液分開培養(yǎng)，分別按照二級培養(yǎng)基2~5%的接種量，所述百分比為體 積體積比，接入裝有二級種子培養(yǎng)基的三角瓶，二級種子培養(yǎng)基的裝液量為三角瓶體積的 20~30%，于28~30℃、180~200r/min振蕩培養(yǎng)18~24h，得到所述三種發(fā)酵菌株的二級種子液；

步驟四、種子罐培養(yǎng)

將所述三種二級種子液共同混合培養(yǎng)，分別按照菌液體積比例的量接種到種子罐中，總 接種量是種子罐培養(yǎng)基體積的3~10%，所述百分比為體積體積比，好氧培養(yǎng)一段時間后，得 到三級種子液；

步驟五、發(fā)酵罐培養(yǎng)

將所述三級種子液，按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基的3~10%的接種量接種到發(fā)酵罐中，所述百分比 為體積體積比，好氧培養(yǎng)一段時間后，得到發(fā)酵產(chǎn)物。

3.根據(jù)權利要求2所述的一種枯草芽孢桿菌的混菌協(xié)同發(fā)酵方法，其特征在于：所述供 生產(chǎn)用的斜面菌種在冰箱內(nèi)保存最多不超過一周。

4.根據(jù)權利要求2所述的一種枯草芽孢桿菌的混菌協(xié)同發(fā)酵方法，其特征在于：二級種 子液經(jīng)顯微鏡觀察菌形正常，無雜菌污染，培養(yǎng)液含活菌數(shù)≥10¹²cfu/ml，方可作為合格的二 級種子應用。

5.根據(jù)權利要求1或2所述的一種枯草芽孢桿菌的混菌協(xié)同發(fā)酵方法，其特征在于：培 養(yǎng)基配方：

（1）其中所述的種子活化培養(yǎng)基為：牛肉膏3~5g/L，蛋白胨3~5g/L，氯化鈉3~5g/L， 葡萄糖5~10g/L，瓊脂10~15g，pH7.0~7.2；

（2）其中所述的一級和二級種子培養(yǎng)基為：葡萄糖20~40g/L，蛋白胨6~10g/L，酵母 浸膏6~10g/L，氯化鈉5g/L，pH7.0~7.2；

（3）其中所述的種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)基為：豆餅粉3~20g/L，牛肉膏2~5g/L，酵母浸 膏3~5gL，尿素5~10g/L,玉米粉3~20gL，蜂蜜5~10gL，麩皮5~10g/L，氯化鈉0.5~3g/L， 碳酸鈉1~2g/L，磷酸氫二鉀1~2g/L，硫酸鎂0.5~3g/L，添加0.05~0.2%消泡劑，所述百分 比為質(zhì)量體積比。

6.根據(jù)權利要求2所述的一種枯草芽孢桿菌的混菌協(xié)同發(fā)酵方法，其特征在于：所述的 三種單一菌株Bacillus?subtilis?B9601-Y2、Bacillus?subtilis?NCD-2和Bacillus?subtilis?BAB-1混 合發(fā)酵的接種配比為2~4:1~2:2~4。