[發(fā)明專利]一種檢測待測蛋白是否為泛素連接酶的底物的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910236487.2
• 申請日: 2009-10-23
• 公開（公告）號: CN101781674A
• 公開（公告）日: 2010-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝旗;劉利靜;張譯月;唐三元
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
• 主分類號: C12Q1/25
• 分類號: C12Q1/25
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測待測蛋白是否為泛素連接酶的底物的方法。

背景技術(shù)

蛋白泛素化系統(tǒng)影響著真核生物生長發(fā)育的各個方面。該影響滲透了生物體的 胚胎生成、細胞周期、基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、生物鐘的形成與維持以及細胞的凋亡等過 程。對植物而言，蛋白泛素化系統(tǒng)還影響著植物根的生長、花的形成、光合作用、 激素調(diào)節(jié)以及植物的對逆境脅迫的適應(yīng)。在蛋白的泛素化過程中主要有泛素活化酶 (E1)、泛素偶聯(lián)酶(E2)和泛素連接酶(E3)三個酶參與，在三個酶的共同作用 下，底物蛋白被加上一個長的泛素鏈，帶有長的泛素鏈的蛋白最終被26S蛋白酶體 所識別并降解，其中泛素連接酶在特異性識別底物過程中起主要作用。

在植物中主要通過三個方面驗證泛素連接酶和底物之間的特異性相互作用： (1)體外表達的泛素連接酶和相應(yīng)的底物可以相互作用；(2)泛素連接酶可以在 體外泛素化相應(yīng)的底物；(3)在泛素連接酶基因缺失或者高表達的植株中，相應(yīng) 底物的表達量升高或降低。這些方法對于蛋白泛素化的研究不可或缺，但存在如下 缺點：(1)體外表達的蛋白由于沒有正常的蛋白翻譯后修飾，其生理生化活性必 然會受到很大的影響，在實驗過程中不可避免的會產(chǎn)生不正確的結(jié)果；(2)體外 的泛素連接酶對底物的反應(yīng)很容易產(chǎn)生假陽性，并且有時由于缺少必要的翻譯后修 飾導(dǎo)致泛素連接酶難以在體外把泛素蛋白加在其底物上；(3)植株突變體鑒定和 轉(zhuǎn)基因植物的獲取需要較長的時間。

在動物中，人們利用在培養(yǎng)的細胞中瞬時表達蛋白的方法來研究蛋白泛素連接 酶與其相應(yīng)底物的特異性反應(yīng)。這種方法方便快捷，并且蛋白量大更利于后續(xù)試驗 的實施。在植物中至今尚沒有相應(yīng)的快速檢測蛋白泛素化的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測待測蛋白是否為泛素連接酶的底物的方法。

本發(fā)明提供的檢測待測蛋白是否為泛素連接酶的底物的方法，包括如下步驟：

1)用DNA片段I和p19基因瞬時轉(zhuǎn)染煙草葉片，得到煙草葉片甲；所述DNA 片段I為帶有標記基因A的待測蛋白基因；將含有泛素連接酶基因的DNA片段II和 p19基因瞬時轉(zhuǎn)染煙草葉片，得到煙草葉片乙；

2)進行如下a)或b)或c)的操作：

a)檢測煙草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白是否與煙草葉片乙中的泛素連 接酶結(jié)合；

b)檢測煙草葉片乙中的泛素連接酶是否促進煙草葉片甲中的帶有標記的待 測蛋白降解；

c)檢測煙草葉片乙中的泛素連接酶是否促進煙草葉片甲中的帶有標記的待 測蛋白與泛素蛋白連接。

所述泛素連接酶的基因可如GenBank?Accession?Number：NM_128855.3自5’ 端第68至2095位核苷酸序列所示；所述p19基因可如GenBank?Accession?Number： NC_001554.1所示。

所述DNA片段II可包括所述泛素連接酶基因和標記基因B；所述標記基因B與 所述標記基因A不同。

所述p19基因具體可通過重組質(zhì)粒35S:p19瞬時轉(zhuǎn)染所述煙草；所述DNA片段 II具體可通過重組質(zhì)粒35S:MYC-COP1瞬時轉(zhuǎn)染所述煙草；所述重組質(zhì)粒35S:p19 是在pCambia-1300221的多克隆位點間插入GenBank?Accession?Number： NC_001554.1所示的DNA得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒35S:MYC-COP1是在 pBA002-MYC的多克隆位點間插入GenBank?Accession?Number：NM_128855.3自5’ 端第68至2095位核苷酸序列所示的DNA得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒35S:p19 具體可為在pCambia-1300221的BamHI和SacI位點間插入GenBank?Accession Number：NC_001554.1所示的DNA得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒35S:MYC-COP1 具體可為在pBA002-MYC的SmaI和SpeI位點間插入GenBank?Accession?Number： NM_128855.3自5’端第68至2095位核苷酸序列所示的DNA得到的重組質(zhì)粒。

所述步驟2)中，可通過如下方法檢測煙草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白是 否與煙草葉片乙中的泛素連接酶結(jié)合：