[發明專利]一種檢測乙肝e抗原的磁性免疫層析試紙條及其制備方法

無效

• 申請號: 200910236334.8
• 申請日: 2009-10-16
• 公開（公告）號: CN101750498A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 詹先發;應希堂;胡國茂;鄭金來;唐寶軍;于尚永
• 申請（專利權）人: 北京科美東雅生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/576;G01N33/543;G01N33/532
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技術領域

本發明屬于醫學檢驗領域，特別是涉及一種檢測乙肝e抗原的磁性免疫層析試紙條及其制備方法。

背景技術

乙型肝炎由乙型肝炎病毒(HBV)引起，HBV是一種包含部分雙鏈環狀DNA基因組的包膜病毒，屬于肝DNA病毒科。當病毒在肝細胞中復制時，可以干擾肝臟的功能，隨即免疫系統激活產生一系列特異的反應以對抗并根除傳染性因素。作為一種病理性損傷的結果，肝臟發生炎癥。持續的HBV感染導致的嚴重的病理學結果包括：慢性肝臟功能不全，肝硬化和肝細胞癌(HCC)。

HBeAg在乙型肝炎病毒感染后與乙肝表面抗原陽性同時或其后出現，HBsAg在血內的高峰期亦是HBeAg的高峰期。HBeAg陽性說明乙型肝炎病毒在體內復制活躍，傳染性強，HBeAg在HBsAg轉陰前可先轉陰。如果HBeAg持續陽性，則可發展為慢性持續性乙型肝炎病毒感染。

目前的HBeAg病原學診斷技術主要包括酶聯免疫試驗(ELISA)、化學發光(CLIA)、免疫層析法(膠體金或乳膠顆粒法)，這些方法都有各自的特點和適用對象。

ELISA和CLIA方法是目前臨床免疫分析中普遍使用檢測技術，但反應時間相對較長，而且都需要酶標儀或發光儀和洗板機以及溫箱等復雜設備，無法滿足臨床急診術前檢測，搶救前指導用藥的要求，也限制了在一些基層醫療單位的應用。膠體金或乳膠顆粒為代表的快速檢測試紙條，缺點是結果需要肉眼觀察，容易受觀察者主觀判斷的影響，且靈敏度較低。

磁性免疫層析(Mgnetic?ImmunoChromatographic?Test，MICT)是近年來出現的一種單人份快速定量檢測技術。它是以超順磁性顆粒(superPMPs)代替傳統的標記物(膠體金，乳膠顆粒等)來進行免疫層析，通過檢測測量磁場強度來示蹤待測樣品的含量。該技術與傳統技術相比具有下述優勢：a.所用磁性檢測儀器采用固相元件，微型化設計自成一體，獨立運行，體積小，操作簡便；b.靈敏度比各類目測快速診斷法高10-100倍；c.讀數快速，可在15秒內測量到多達6個分析位點的數據；d.線形范圍可達4個濃度數量級的范圍內呈線性；e.超順磁性納米微粒由聚合物包被，不會隨時間而衰變。該技術繼承了傳統免疫層析法(膠體金，乳膠顆粒等)簡便快速，單人份操作的優點，又彌補了傳統免疫層析技術靈敏度低，只能定性，不能定量的缺點，是當今即時檢驗(Point?of?CareTest，POCT)技術發展的先進代表。

目前常用的標記磁顆粒為超順磁顆粒(superPMPs)，沒有外加磁場的情況下不具有任何磁性，只有在外加磁場作用下才會表現出磁性，商品化超順磁顆粒都經過表面修飾，大大方便了標記過程，標記簡便，重復性好。

發明內容

本發明的目的即是將磁性免疫層析技術應用在HBeAg免疫分析中。將HBeAb共價偶聯于超順磁顆粒上，將HBeAb包被于硝酸纖維素膜上制成檢測線作為捕獲固相，按照常規免疫層析法的原理進行標本的檢測，結合簡便易行的磁性檢測儀進行檢測，可以實現快速靈敏地檢測，本技術既可以單人份檢測，也可以批量檢測，并且可以即時給出定量結果，測量儀器簡單可靠，操作簡便，方便實用。

為達到上述的目的，本發明的技術方案如下：將包被膜、結合HBeAb的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊、依次相互交錯2mm地粘貼在底板上，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜而制成，其中所述的包被膜上預包被有HBeAb檢測線，以及預包被了二抗的質控線。

選用的底板為透明塑料底板，包被膜為35mm寬度的硝酸纖維素膜，選用的吸水墊為纖維素膜，磁顆粒墊為玻璃纖維墊，樣品墊為經過樣品墊處理液預處理的纖維素膜。所述的樣品墊處理液是含有1％-5％酪蛋白(casein)和0.1％-1％的聚乙烯醇(PVP)，以及0.01-0.2％吐溫-20(Tween-20)的0.02M，pH7.0-7.6的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。

檢測乙肝e抗原的磁性免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟：

A、磁顆粒的制備：選用直徑為50-300nm的超順磁顆粒，使用碳二亞胺(EDC)和琥珀酰亞胺(NHS)共價偶聯的方式將二抗標記到磁顆粒上，將HBeAb以1∶3-1∶10的比例(體積比)與二抗標記磁顆粒混合；

B、將制備好的磁顆粒使用定量噴液裝置以25μl/cm-50μl/cm的量噴涂于磁顆粒墊上；

C、包被膜的制備：使用包被緩沖液分別將HBeAb以及二抗稀釋到0.5-2mg/m的濃度，使用定量噴液裝置分別將二者以0.5-1.0cm的間隔于硝酸纖維素膜上，晾干后于封閉液中浸泡10分鐘后于25-35℃烘干8小時，加入干燥劑封存備用；