[發明專利]乳鏈菌肽突變體蛋白及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 200910235510.6
• 申請日: 2009-09-29
• 公開（公告）號: CN101691397A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發明（設計）人: 鐘瑾;路遙;陳美玲;還連棟
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12N15/63;C12N1/00;C12N1/21;C12N5/10;C12P21/02;A01N43/50;A01P1/00;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及乳鏈菌肽突變體蛋白及其編碼基因與應 用。

背景技術

乳鏈菌肽(nisin)是由某些乳酸菌菌株產生的細菌素，其可抑制多種革蘭氏 陽性細菌的生長繁殖，并對人體安全無毒。目前在自然界共發現了6種nisin的天 然突變體，其中nisin?A和nisin?Z作為天然食品防腐劑已被廣泛應用于食品行業。 Nisin?A與nisin?Z都由34個氨基酸殘基組成，其差別僅在于氨基酸順序上第27 位氨基酸的不同，nisin?A是組氨酸(His)，而nisin?Z是天冬酰胺(Asp)。

Nisin由核糖體生物合成，其翻譯后修飾過程包括絲氨酸蘇氨酸殘基的脫水及 與半胱氨酸形成硫醚環。Nisin分子主要由兩個結構域組成：N-端結構域(包括A、 B、C三個硫醚環)和C-端結構域(包括D和E兩個相互纏繞的環及靠近C-端的柔性 氨基酸尾巴)，兩者通過一個柔性鉸鏈區相連接。在氨基酸構成上，N-端的疏水氨 基酸殘基較多，C端則由于含有帶正電荷的賴氨酸(Lys)和組氨酸(His)殘基而 相對親水，這使nisin分子呈現兩親性。而NMR研究也發現nisin分子不但在氨基 酸組成上呈現兩性，其N-端結構域中的A、B和C環及C-端結構域中的D和E環還 具有疏水面和親水面的雙親結構。

Nisin不僅對引起食品腐敗和對人體健康有害的許多革蘭氏陽性菌有強烈抑制 作用，且其經食用后能被α-胰凝乳蛋白酶等降解，無抗藥性，也不會改變腸道正 常菌群，對人體安全無毒，是一種被廣泛應用的天然食品生物防腐劑。然而，隨著 乳鏈菌肽產品的日益推廣使用，人們對其生產與應用的要求也越來越高，例如，乳 鏈菌肽抑菌譜較窄，只能抑制革蘭氏陽性菌，且只在物理(脈沖電場)或化學(EDTA) 處理條件下才能抑制革蘭氏陰性菌；乳鏈菌肽只在低pH條件下表現較高穩定性和 溶解度，而在高pH條件下溶解度低也不穩定，易裂解失活等等。因此，在研究乳 鏈菌肽的生物合成途徑、代謝調控及其作用機制等基礎上，利用微生物代謝工程、 基因定點突變等手段，對乳鏈菌肽進行改造和優化，將很好地改善乳鏈菌肽產品性 能，擴大乳鏈菌肽產品應用范圍，提升產品競爭力。近年來，國內外研究者對乳鏈 菌肽分子的結構與功能開展了較多的探索，主要是針對硫醚環的部分氨基酸進行了 定點突變研究，但大多是負結果，只有鉸鏈區氨基酸殘基的定點突變取得了一些正 面結果(Yuan?J?et?al.Applied?Microbiology?and?Biotechnology?64：806-815)。 對nisin分子C-端的柔性氨基酸尾巴研究和關注較少。

發明內容

本發明的目的在于提供一種乳鏈菌肽突變體蛋白，該蛋白與野生型乳鏈菌肽相 比，具有更廣的抑菌譜以及更高的穩定性。

本發明提供的乳鏈菌肽突變體蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列組 成的蛋白質。

上述蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍之內。

上述基因是如下1)或2)或3)或4)的基因：

1)其編碼序列是序列表中序列1自5’端的第313位到第417位所示的基因；

2)其編碼序列是序列表中序列1自5’端的第244位到第417位所示的基因；

3)在嚴謹條件下與1)或2)限定的基因雜交且編碼上述的蛋白的基因；

4)與1)或2)限定的基因具有90％以上的同源性且編碼上述蛋白的基因。

上述嚴謹條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者 RNA雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。

含有上述基因的重組載體也屬于本發明的保護范圍之內。

上述重組載體是將含權利要求2或3所述基因的片段插入pMG36e的多克隆位 點之間，得到重組表達載體；

所述含權利要求2或3所述基因的片段的核苷酸序列如序列表中序列1自5’ 端的第1位到第463位所示。

含有上述基因的重組菌或轉基因細胞系也屬于本發明的保護范圍之內。

上述重組菌是將上述的重組載體導入乳酸菌中得到的重組乳酸菌；所述乳酸菌 是L.lactis?NZ9800。

上述的重組菌在生產上述乳鏈菌肽突變體蛋白中的應用也屬于本發明的保護 范圍。

本發明的又一目的在于提供一種抑菌劑。所述抑菌是抑制革蘭氏陽性菌。