[發明專利]一種同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 200910234026.1
• 申請日: 2009-11-19
• 公開（公告）號: CN101928782A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發明（設計）人: 張志成;范紅結;陳鐘鳴;戴鼎震;方光遠;何小明
• 申請（專利權）人: 金陵科技學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N27/447;C12R1/93
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種用于同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的引物對，其特征在于如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示的核苷酸序列。

2.一種同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的試劑盒，其特征在于包括權利要求1所述的引物對。

3.根據權利要求2所述的同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的試劑盒，其特征在于包括：

(1)豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株陽性對照細胞滅活毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株陽性對照細胞滅活毒各600uL；

(2)豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株和經典株特異性引物對：

針對NSP2基因：上游引物P1：如SEQ?ID?NO：1所示；

下游引物P2：如SEQ?ID?NO：2所示；

針對NSP9基因：上游引物P3：如SEQ?IDNO：3所示；

下游引物P4：如SEQ?ID?NO：4所示；

(3)RNA提取試劑：由Trizol?12mL，無菌DEPC水450μL；

(4)RT-PCR反應試劑：由RT反應液200μL，其中含反轉錄引物序列：RT引物如SEQ?ID?NO：4所示，RNA酶抑制劑24μL，AMV反轉錄酶12μL，5×buffer?60μL，dNTP25μL，2×PCR?Master?Mix?200μL組成；

(5)電泳檢測試劑：由50×TAE電泳緩沖液20mL，GoldView?100μL組成。

4.采用權利要求1所述的試劑盒同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的方法，其特征在于它包括如下步驟：

(1)RNA的提取：

(1a)取待檢組織0.5g，置于勻漿器或者研缽研碎后用1.5mL?D-Hanks液稀釋；取已研磨好的待檢組織液，置1.5mL滅菌離心管中，6000rpm離心5min；

(1b)取步驟(1a)離心得到的上清液300μL于1.5mL滅菌離心管中，加入1mL?Trizol混勻，室溫下放置10min；再加入200μL氯仿混勻，室溫下放置2min；

(1c)將步驟(1b)的滅菌離心管12000rpm離心10min，取600μL上層水相到另一1.5mL滅菌離心管中，加入600μL異丙醇混勻，室溫下放置10min；

(1d)將步驟(1c)的滅菌離心管12000rpm離心10min，去上清，加入-20℃預冷的75％(v/v)乙醇溶液500μL，旋渦震蕩混勻，7500rpm離心3min；

(1e)去除步驟(1d)離心后的上清，37℃干燥，用30μL?DEPC水溶解即用或-70℃保存；

(2)反轉錄：

取16μL?mRNA和如SEQ?ID?NO：4所示的RT引物25pmol/U、0.5μL混勻于PCR管中，放于PCR儀中65℃10min立即冰浴5min，再加入如下試劑：5×buffer?5μL、dNTP2μL、RNA酶抑制劑0.5μL、AMV反轉錄酶0.5μL，置PCR儀中50℃反轉錄1h，95℃3min滅活反轉錄酶后，-20℃保存備用；

(3)PCR：

25μL體系：2×PCR?Master?Mix?12.5μL；ddH₂O?6.5μL；上游引物P1?1μL；下游引物P2?1μL；上游引物P3?1μL；下游引物P4?1μL和模板2μL；

PCR反應條件：95℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃40s，35個循環；72℃8min；

(4)瓊脂糖凝膠電泳：

準確稱取0.3g瓊脂糖，加入20mL?TAE置錐形瓶于微波爐中完全溶解后加入核酸染料GoldView6.0μL并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后將PCR擴增產物取8μL點于已凝固的瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于TAE中電泳1h；

(5)判斷結果：

如果擴增出約680bp和380bp特異性兩條片段，則表明待檢組織豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株陽性；

如果僅擴增出了約380bp特異性片段，則表明待檢組織豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株陽性；

如果沒有擴增出片段，則表明待檢組織豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株和經典均陰性。