[發(fā)明專利]雞傳染性喉氣管炎病毒的HN1株gB基因和雞IL-18基因聯(lián)合核酸疫苗及其制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910227514.X
• 申請(qǐng)日: 2009-12-17
• 公開（公告）號(hào): CN101837132A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳紅英;魏戰(zhàn)勇;楊明凡;崔保安;邵攀峰;劉金朋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K39/39;A61P31/20;A61P11/00
• 代理公司: 鄭州中原專利事務(wù)所有限公司 41109
• 代理人: 張紹琳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種核酸疫苗，具體涉及一種雞傳染性喉氣管炎病毒的HN1株gB基因和雞IL-18基因聯(lián)合核酸疫苗及其制備方法。

背景技術(shù)

雞傳染性喉氣管炎(ILT)是由雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)引起雞的一種急性、高度接觸性上呼吸道傳染病，呈全球性流行，是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。目前國(guó)內(nèi)外防制本病普遍采用弱毒疫苗。這些疫苗的毒力普遍偏強(qiáng)，可以在雞體內(nèi)潛伏感染，而且在雞體傳代過程中毒力返強(qiáng)。因此，研制更安全而有效的疫苗，將有利于徹底控制乃至根除ILT。

核酸疫苗技術(shù)作為一種新的免疫接種手段問世不久就在感染性疾病及腫瘤的防治中顯示出巨大的潛力。所謂核酸疫苗，就是將含有可表達(dá)的病原微生物的抗原基因整合到某種適宜的質(zhì)粒DNA中，置于真核表達(dá)元件的控制之下，構(gòu)成重組質(zhì)粒DNA，然后將這種編碼某種抗原蛋白的基因質(zhì)粒DNA直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)合成抗原蛋白，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫效應(yīng)的真核表達(dá)載體質(zhì)?？煞Q為基因疫苗(genetic?vaccine)或核酸疫苗(nucleic?acid?vaccine)或DNA疫苗(DNA?vaccine)，它是繼病原體疫苗、亞單位疫苗之后的第三代疫苗。在1994年5月的世界衛(wèi)生組織大會(huì)上，與會(huì)專家充分肯定了核酸疫苗應(yīng)用的潛在價(jià)值，并認(rèn)為核酸疫苗的研究發(fā)展與未來實(shí)施的用一種疫苗預(yù)防多種傳染病的計(jì)劃是一致的。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，核酸疫苗不僅可用于人類疾病，而且還可廣泛應(yīng)用于人畜共患病和動(dòng)植物疾病。它不僅對(duì)預(yù)防疾病有作用，還能治療疾病。因此，在不久的將來，核酸疫苗有望成為人類防治疾病的重要手段。

以往的傳統(tǒng)疫苗在疫病防治上曾作出了輝煌的成就，如英國(guó)醫(yī)生Jenner用牛痘苗(1798)預(yù)防天花并獲得成功，但傳統(tǒng)的減毒、滅活疫苗的潛在致病性和亞單位疫苗免疫反應(yīng)的不完全性迫使人們繼續(xù)尋找更為理想的免疫接種劑。近年來，一種誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的新手段即基因免疫正在悄然興起，目前它已經(jīng)成為國(guó)際疫苗學(xué)及生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，其研究范圍越來越廣，研究程度也日漸深入。世界上第一例DNA疫苗是用于治療艾滋病的HIVDNA疫苗，1996年已批準(zhǔn)在健康人身上進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)。

DNA疫苗由病原抗原編碼基因及載體質(zhì)粒兩部分組成?？乖蚩梢允菃蝹€(gè)基因或完整的一組基因，也可以是編碼抗原決定簇的一段核苷酸序列。對(duì)載體質(zhì)粒的一般要求是：1)在大腸桿菌中可以高拷貝地復(fù)制；2)在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，但不能含有促進(jìn)整合入宿主細(xì)胞染色體基因組的序列。DNA疫苗一般以載體質(zhì)粒為基本骨架，帶有細(xì)菌復(fù)制子和真核生物的啟動(dòng)子，有的還含有增強(qiáng)子和多聚polyA加尾信號(hào)。啟動(dòng)子多采用CMV、SV40、RSV、LTR及β-actin啟動(dòng)子序列，它們都具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，在多種動(dòng)物細(xì)胞中能高效表達(dá)。以CMV的轉(zhuǎn)錄活性最高，其中又以帶intronA的轉(zhuǎn)錄活性最好，intronA內(nèi)部含有某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合信號(hào)，可能是促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的原因。還采用在質(zhì)粒中加入增強(qiáng)子序列、終止/加工元件、促T細(xì)胞激活的共刺激分子及細(xì)胞因子等手段來提高DNA疫苗的免疫刺激作用，免疫增強(qiáng)效果。雖然強(qiáng)啟動(dòng)子可以產(chǎn)生較好的表達(dá)及免疫應(yīng)答，但弱啟動(dòng)子可能誘導(dǎo)長(zhǎng)期的持續(xù)性免疫應(yīng)答。

外源基因在啟動(dòng)子作用下表達(dá)相應(yīng)的蛋白，表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)被降解成為若干短肽，這些短肽含有不同的表位，分別與MHC-I類和MHC-II類分子結(jié)合，并提呈給CD8⁺和CD4⁺T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。與MHC-I類分子結(jié)合的短肽激活CD8⁺T細(xì)胞(CTL)，與MHC-II類分子結(jié)合的短肽則激活CD4⁺T細(xì)胞，產(chǎn)生大量的抗體外源基因直接在宿主體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和加工，能完整保留產(chǎn)物的天然結(jié)構(gòu)和抗原性，而且抗原在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與病毒自然感染過程一致，這對(duì)于構(gòu)象依賴型抗原表位誘發(fā)中和抗體的產(chǎn)生極為重要。DNA疫苗誘導(dǎo)的Th1反應(yīng)產(chǎn)生與補(bǔ)體結(jié)合的IgG亞類，可活化吞噬細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞)，與補(bǔ)體結(jié)合抗體共同抵抗入侵的細(xì)菌和病毒；Th2反應(yīng)產(chǎn)生IgG和非補(bǔ)體結(jié)合性Ig亞類，活化非吞噬性細(xì)胞(如肥大細(xì)胞)的防衛(wèi)反應(yīng)，對(duì)控制蠕蟲和黏膜免疫更有效。

在基因免疫中外源質(zhì)粒DNA起到疫苗作用，并能模擬病原體胞內(nèi)自然感染過程，使表達(dá)的外源蛋白以自然加工形式遞呈給免疫識(shí)別系統(tǒng)，從而有效地誘導(dǎo)全方位的免疫應(yīng)答。因此，用基因免疫技術(shù)研制的DNA疫苗，與傳統(tǒng)方法研制的疫苗相比具有以下特點(diǎn)：