[發(fā)明專利]鑒定礦化刺激因子的基質(zhì)蛋白單克隆抗體及鑒定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910219294.6
• 申請(qǐng)日: 2009-12-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101709090A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-05-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張榮慶;謝莉萍;李琪;上官俊龍;劉曉軍;周玉娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;G01N33/577
• 代理公司: 西安智大知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61215
• 代理人: 賈玉健

1.一種鑒定礦化刺激因子的基質(zhì)蛋白單克隆抗體，其特征在于，專一性識(shí)別合浦珠母貝基質(zhì)蛋白。

2.一種利用權(quán)利要求1所述基質(zhì)蛋白單克隆抗體鑒定與礦化相關(guān)的基質(zhì)蛋白刺激因子的方法，其特征在于，該鑒定方法具體按以下步驟進(jìn)行：

步驟1：取合浦珠母貝的外套膜細(xì)胞，利用普通培養(yǎng)基采用組織塊法原代培養(yǎng)2天～4天，然后，根據(jù)需鑒定的刺激因子的種類，將不同刺激因子分別加入該培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)2天～4天，得到含有外套膜分泌的基質(zhì)蛋白的培養(yǎng)基；

步驟2：取BALB/c小鼠進(jìn)行4次免疫，將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合，然后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的方法篩選出陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，將該陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆，并篩選出特異性識(shí)別基質(zhì)蛋白的單克隆雜交瘤細(xì)胞，將該單克隆雜交瘤細(xì)胞注射到正常BALB/c小鼠體內(nèi)，獲取該小鼠的腹水，將該腹水親和純化獲得單克隆抗體；

步驟3：取新西蘭兔，用基質(zhì)蛋白進(jìn)行4次免疫，取得基質(zhì)蛋白多克隆抗體；

步驟4：分別取20mM碳酸鈉緩沖液和步驟3取得的基質(zhì)蛋白多克隆抗體，用碳酸鈉緩沖液對(duì)該基質(zhì)蛋白多克隆抗體進(jìn)行稀釋，制成濃度為2μg/ml～10μg/ml、pH值為9.2～9.4的多克隆抗體稀釋液，然后，分別取該多克隆抗體稀釋液和96孔酶標(biāo)板，在該96孔酶標(biāo)板的每孔中分別加入100μl～150μl多克隆抗體稀釋液，置于4℃的溫度條件下，孵育1小時(shí)～2小時(shí)，將孵育后的96孔酶標(biāo)板用磷酸緩沖液洗滌4次；

步驟5：按重量比，分別取羊血清3％～5％、牛血清白蛋白3％～5％和純水90％～94％，混合形成封閉液，各組份總量100％；

步驟6：分別取步驟4洗滌后的96孔酶標(biāo)板和步驟5制得的封閉液，在96孔酶標(biāo)板每孔中分別加入100μl～150μl封閉液，然后，在37℃的溫度下，封閉1小時(shí)～2小時(shí)；

步驟7：分別取普通培養(yǎng)基、步驟1得到的含有外套膜分泌的基質(zhì)蛋白的培養(yǎng)基和步驟6封閉完成的96孔酶標(biāo)板，將普通培養(yǎng)基和含有外套膜分泌的基質(zhì)蛋白的培養(yǎng)基各250μl分別加入96孔酶標(biāo)板的孔內(nèi)，每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)平行對(duì)照，然后，在37℃的條件下，孵育小時(shí)～2小時(shí)，之后，用磷酸緩沖液將基質(zhì)蛋白與多克隆抗體結(jié)合后的96孔酶標(biāo)板洗滌4次；

步驟8：分別取碳酸鈉緩沖液和步驟2制得的單克隆抗體，將該單克隆抗體用20mM碳酸鈉緩沖液稀釋，制成濃度為2μg/ml～10μg/ml、pH值為9.2～9.4的單克隆抗體稀釋液，將該單克隆抗體稀釋液加入步驟7洗滌后的96孔酶標(biāo)板孔內(nèi)，控制96孔酶標(biāo)板每孔內(nèi)分別加入100μg單克隆抗體稀釋液，之后，將加入單克隆抗體稀釋液的96孔酶標(biāo)板置于37℃的溫度下，孵育1小時(shí)～2小時(shí)，然后，將單克隆抗體與基質(zhì)蛋白結(jié)合后的96孔酶標(biāo)板用磷酸緩沖液洗滌4次；

步驟9：按體積比1∶1500，分別取辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親合素和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親合素稀釋液，對(duì)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親合素進(jìn)行稀釋，得到辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親合素稀釋溶液；

步驟10：分別取步驟9制得的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親合素稀釋溶液和步驟8洗滌后的96孔酶標(biāo)板，在該96孔酶標(biāo)板每孔內(nèi)分別加入150μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親合素稀釋溶液，然后，置于37℃的溫度下孵育1小時(shí)～2小時(shí)，之后，將孵育后的96孔酶標(biāo)板用磷酸緩沖液洗滌4次；

步驟11：分別取鄰苯二胺和pH值為5.0的檸檬酸緩沖液，按10ml檸檬酸緩沖液中加入10mg鄰苯二胺的比例，將鄰苯二胺加入檸檬酸緩沖液中，混合均勻，得到混合液，在該混合液使用前，按每10ml該混合液中加入18μl雙氧水的比例，將雙氧水加入混合液中，制得鄰苯二胺底物溶液；

步驟12：分別取步驟11制得的鄰苯二胺底物溶液和步驟10洗滌后的96孔酶標(biāo)板，在該96孔酶標(biāo)板每孔中分別加入150μl鄰苯二胺底物溶液，進(jìn)行避光顯色，顯色10分鐘～30分鐘后，在96孔酶標(biāo)板每孔中分別加入濃度1M的H₂SO₄溶液30μl，終止反應(yīng)，然后，采用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度；

步驟13：根據(jù)步驟12中測(cè)得的490nm波長(zhǎng)下的吸光度，通過(guò)對(duì)比加入刺激因子的培養(yǎng)基和空白對(duì)照組培養(yǎng)基的吸光度值，比較基質(zhì)蛋白濃度變化，鑒定該刺激因子是否促進(jìn)基質(zhì)蛋白的分泌。

3.按照權(quán)利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟4中采用Costar公司生產(chǎn)的96孔酶標(biāo)板。