[發(fā)明專利]利用轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染牛體細胞成為誘導(dǎo)性多能干細胞的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910218982.0
• 申請日: 2009-11-16
• 公開（公告）號: CN101705248A
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳冬梅;呂長榮;辛?xí)粤?/a>;竇忠英
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 西安西達專利代理有限責任公司 61202
• 代理人: 李文義

1.一種利用轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染牛體細胞成為誘導(dǎo)性多能干細胞的方法，包 括如下步驟：

1)牛皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng)

以成年牛皮膚成纖維細胞BDF和新生牛皮膚成纖維細胞NDF，經(jīng)常規(guī)培 養(yǎng)后分別獲得大量的成年牛皮膚成纖維細胞和新生牛皮膚成纖維細胞；

2)牛維持多能性轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及其逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建

從50-60日齡牛胎兒中分離生殖嵴，提取總RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到 cDNA；以cDNA為模板，經(jīng)過PCR反應(yīng)得到牛Oct4、Sox2、c-Myc與Klf4 四個基因擴增產(chǎn)物并經(jīng)測序驗證序列正確而后將目的基因插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體pMSCVneo中，構(gòu)建這4種基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體；

3)逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝與準備

PT67包裝細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，待細胞達到 70％-80％匯合時，應(yīng)用脂質(zhì)體將逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染進入包裝細胞PT67細胞，進 行病毒包裝以獲得具有感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；轉(zhuǎn)染前1小時，DMEM培養(yǎng) 基換成無血清培養(yǎng)液，4-8μg逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DNA和10-20μl脂質(zhì)體分別加 入到500μl?Opti-MEM-I+GlutaMAX-I優(yōu)化轉(zhuǎn)染液中，輕柔混勻，室溫孵育， 然后將稀釋的質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體輕柔混勻，再室溫孵育20分鐘后，將混合 液逐滴加入PT67細胞培養(yǎng)皿中；細胞在37℃，5％CO₂和飽和濕度條件下培 養(yǎng)4-6h后，轉(zhuǎn)染液換成新的含15％FBS的DMEM培養(yǎng)液；經(jīng)過24小時轉(zhuǎn)染 后，收集PT67細胞培養(yǎng)液上清，該上清中就包含感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；上 清液經(jīng)過0.45μm孔徑的濾膜過濾，每24小時收集一次，連續(xù)收集3d；病毒 懸浮液在4℃條件下，經(jīng)過25,000轉(zhuǎn)/分，離心90分鐘，10倍濃縮病毒上清液， 將Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四種基因病毒上清液進行等量混合，并添加8 μg/ml?polybrene組成特定的四因子基因組合，-80℃保存，準備轉(zhuǎn)染牛皮膚成 纖維細胞；

4)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染牛皮膚成纖維細胞以及牛的iPS細胞的獲得

將成年牛皮膚成纖維細胞BDFs和新生公牛皮膚成纖維細胞NDFs按照常 規(guī)方法培養(yǎng)在60mm塑料培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)皿中細胞生長到70-80％融合時將 包含Oct4、Sox2、c-Myc與Klf4基因轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液的混合 液分別加入到成纖維細胞BDFs與NDFs培養(yǎng)皿中感染成纖維細胞；細胞長滿 培養(yǎng)皿后按1∶3常規(guī)傳代，視細胞生長情況在第6-10d將細胞以1×10⁵細胞 /孔的密度，轉(zhuǎn)移至預(yù)先鋪有人羊膜(HAM)6孔培養(yǎng)板上，作為飼養(yǎng)層培養(yǎng) 感染后的牛細胞，同時培養(yǎng)液更換成干細胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)孔內(nèi)每天半量換液， 連續(xù)觀察20-28d，直到有細胞集落出現(xiàn)為止，記為0代，即為牛iPSCs；

所述的干細胞培養(yǎng)液的組成為：每100ml溶液中含有：82.69ml的 knockout-DMEM、15ml?FBS、1ml濃度為200mM谷氨酰胺、1ml濃度為10 mM非必需氨基酸、200μl濃度為55mM?β-巰基乙醇、10μl濃度為400ng/ml 人重組堿性成纖維生長因子、100μl濃度為105U/mL白血病抑制因子。