[發明專利]FMU-EPCAM-2A9單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區

有效

• 申請號: 200910218795.2
• 申請日: 2009-11-06
• 公開（公告）號: CN101701039A
• 公開（公告）日: 2010-05-05
• 發明（設計）人: 金伯泉;楊琨;張葵;宋朝君;孫元杰;謝鑫;朱參勝
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N15/13;G01N33/577
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，涉及一種單克隆抗體，特別涉及一種抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區，包括其氨基酸序列和核苷酸序列。

背景技術

上皮細胞黏附分子(EPCAM)最初是作為結腸癌的優勢表位被發現，當時認為其作用是細胞黏附和治療用抗體的可靠結合位點。目前研究認為，EPCAM是糖基化的I型跨膜糖蛋白，分子量為30到40kD，其結構包括有一個表皮生長因子樣和一個甲狀腺球蛋白樣的胞膜外區，一段跨膜區和一段26個氨基酸的胞漿區。在正常細胞中EPCAM主要位于上皮細胞間隙的緊密連接處。由EPCAM表達的強度和頻率顯示，其基本上高表達于所有人類腺癌、部分鱗狀細胞癌、視網膜母細胞瘤和肝細胞癌。

2007年以前對EPCAM功能方面的研究發現：EPCAM在細胞增殖、遷移和信號轉導中具有重要作用。例如：EPCAM在人和嚙鼠動物細胞的增強表達，增強了細胞錨定和血清生長因子非依賴的增殖并且增加了如c-myc和cyclins在內的各種靶基因的表達；在乳腺癌細胞系，EPCAM信號經RNA干涉，可造成細胞增殖、遷移和侵襲能力的降低。

最近的研究證實：EPCAM可以作為一些實體腫瘤干細胞的表面標志物之一，也可以作為正常干細胞表面標志物的組成部分。同時，研究結果還很好地解釋了EPCAM在腫瘤細胞高表達的原因，并且發現其與一些腫瘤患者預后較差和生存率較低有關；并進一步解釋了EPCAM與腫瘤的關系。此外，小鼠胚胎干細胞實驗證實，EPCAM在腫瘤干細胞、正常干細胞上的高表達和其自身正反饋的上調，對確保維持這些正常干細胞及以惡性干細胞的增殖非常重要。

抗EPCAM抗體用于腫瘤治療的研究一直是抗體治療研究的熱點。早在1979年開發的鼠源性的抗EPCAM抗體17-1A，于1982年就用于對腫瘤的臨床治療。但是鼠源性抗體藥物在人體使用時，由于其具有免疫原性，會引起人體的免疫反應，從而造成對抗體藥物的清除或免疫復合物介導的超敏反應。對鼠源性抗體基因改造可以部分解決其免疫原性問題，如構建嵌合抗體或人源化抗體等。

抗體單體分子是由兩條相同的重鏈(H鏈)和兩條相同的輕鏈(L鏈)，通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。H鏈和L鏈包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可變區(V區)由高變區/互補決定區(HVR/CDR)和骨架區(FR)組成；靠近C端為恒定區(C區)。重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)形成的蛋白質折疊是抗原結合部位，其中的CDR/HVR是抗體與抗原決定基互補結合的部位，C區引發抗原抗體識別后的反應。抗體根據FR/C區不同可分為人源、鼠源等，鼠源性抗體在人體內使用時具有免疫原性，易引起人體的免疫反應，這些免疫反應可引起對鼠源性抗體的清除以及免疫復合物介導的超敏反應。為了克服鼠源性抗體的缺陷，需要構建高親和力的特異性的嵌合抗體、單鏈抗體或人源化抗體。

在改造過程中，最為重要的是首先必須獲得具有良好特異性和親和力鼠源性親本抗體，克隆其輕鏈和重鏈可變區基因，然后將這兩條基因進行改造，構建重組抗體基因。針對這些問題，抗EPCAM治療性抗體的研發不斷取得進展，抗EPCAM的大鼠和小鼠雙特異性抗體Catumaxomab，單鏈抗體Proxinium，人源化抗體ING-1，人源化的融合抗體EMD和完全人源化抗體Adecatumumab(MT201)等先后進入臨床治療腫瘤的研究。目前在臨床試驗中，通過改造的抗體Adecatumumab治療乳腺癌取得了良好的效果。因此，篩選出高親和力鼠源性抗人EPCAM單克隆抗體，從中克隆出輕、重鏈可變區基因，對進一步改善以EPCAM為靶點的藥物的制備和對腫瘤的治療具有非常重要的意義。

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區，包括其氨基酸和核苷酸序列，為構建高親和力的抗EPCAM嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。

本發明是通過以下技術方案來實現：

FMU-EPCAM-2A9單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區，所述輕鏈可變區的3個互補決定區(CDR)序列分別為：

CDRl：Gln-Ser-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr；

CDR2：Val-Val-Ser-Lys-Leu-Asp-Ser；

CDR3：Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr；

所述重鏈可變區的3個互補決定區(CDR)序列分別為：