[發明專利]一種快速檢測牛奶中金黃色葡萄球菌的試劑盒

無效

• 申請號: 200910217881.1
• 申請日: 2009-11-20
• 公開（公告）號: CN101701252A
• 公開（公告）日: 2010-05-05
• 發明（設計）人: 雷連成;許會會;孫長江;謝芳;杜崇濤;馮新;韓文瑜
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/445
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域

本發明公開一種快速檢測牛奶中金黃色葡萄球菌的試劑盒，利用環介導等溫擴增 (LAMP)技術檢測牛奶中金黃色葡萄球菌，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus，S.aureus)簡稱金葡菌，球形，直徑0.8μm， 在顯微鏡下排列成葡萄串狀，無芽孢、鞭毛，大多數無莢膜，革蘭氏染色陽性。金葡 菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可以找到，是引起 細菌性食物中毒的主要病原菌，而且在國家鮮乳標準中列為不得檢出的項目。目前國 標法仍采用傳統的培養方法，但步驟繁瑣、耗時長、成本高、靈敏性差等缺點。雖然 近幾年出現了一些簡便快速的技術，但是，直接應用于牛奶中的金葡菌檢測，仍然不 可行，因為，牛奶中的蛋白質和脂肪等物質給檢測帶來了很大的影響，因此，開發一 種快速檢測牛奶中金葡菌的技術已成為主要的發展趨勢。

發明內容

本發明公開了一種快速檢測牛奶中金黃色葡萄球菌的試劑盒，建立了一種快速、 靈敏的用于牛奶中的金黃色葡萄球菌檢測的方法，適用于牛奶中金葡菌的定性檢測。

本發明還進一步提供了該試劑盒的制備方法，適用于工業化生產。

本發明的快速檢測牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的試劑盒，具體構成如下：

1)免疫微球：聯接金黃色葡萄球菌抗體的羧基微球。

2)兩對引物為：

外引物

F3：GCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGT；

B3：GATGCTTTGTTTCAGGTGTA；

內引物

FIP：CTGTTGGATCTTCAGAACCACTT-GCTCAGCAAATGCATCAC；

BIP：GAACCTGCGACTTTAATTAAAGCGA-TCTGAATGTCATTGGTTGAC；

3)LAMP反應液：由0.6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、10mmol/L氯化鉀、 10mmol/L硫酸銨、8mmol/L硫酸鎂、0.1％TritonX-100、1.0mol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP 各1.6μmol/L、外引物各0.2μmol/L。

4)陽性對照液：金黃色葡萄球菌基因組DNA。

5)陰性質控標準品：無菌雙蒸水。

本發明試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

1、免疫微球

1)金黃色葡萄球菌多克隆抗體的制備

A：將經鑒定的金黃色葡萄球菌接種到LB培養液中，37℃、200r/min搖床過夜 培養，計數，用0.3％甲醛溶液37℃滅活24h，涂平板檢驗無活菌后用生理鹽水洗滌兩 次，最后用200μL生理鹽水重懸，并調整其濃度為1×10⁹CFU/ml，與200μL弗氏完全 佐劑充分乳化，作為免疫原。

B：取兩只體重1kg左右雄性健康新西蘭大白兔，取以上免疫原皮下多點注射。 首次免疫后間隔兩周加強免疫，免疫劑量1×10¹⁰CFU/ml，200μL菌液與200μL弗氏不 完全佐劑充分乳化，皮下多點注射，每隔兩周進行一次，第三次免疫一周后耳靜脈采 血測效價。當效價達到1∶1000時加強免疫一次一周后心臟放血分離血清，經HiTrap Protein?A?HP純化柱純化后，置于-20℃保存。

2)免疫微球的制備

A：取微球原液超聲波震蕩30s，然后用去離子水洗滌一次。

B：加入羧基微球表面活化劑，室溫震蕩20min，離心洗滌一次，重懸于100μL?PBS 中。

C：加入多克隆抗體，漩渦震蕩混勻，室溫震蕩2h，洗滌離心兩次，重懸于含1％ BSA的100μL?PBS中，室溫震蕩4h，4℃過夜以阻斷微球表面未結合位點。

D：用洗滌液洗滌微球2次，重懸于100μL?PBS中，4℃備用。

2、兩對引物

根據金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶(nuc)基因(Genbank登錄號V01281)，利用 Primer?ExplorerV4設計引物如下：

外引物

F3：GCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGT；

B3：GATGCTTTGTTTCAGGTGTA；

內引物