[發明專利]一種生產藥用重組人溶菌酶的方法

無效

• 申請號: 200910216488.0
• 申請日: 2009-12-02
• 公開（公告）號: CN102086460A
• 公開（公告）日: 2011-06-08
• 發明（設計）人: 黃曉川
• 申請（專利權）人: 黃曉川
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/56;C12N9/36;G01N33/573;A61K38/47;A61P31/04;A61P31/12
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技術領域

本發明屬于生物制藥技術領域，涉及一種藥用蛋白質的制備方法，具體的說是涉及以馬鈴薯為生物反應器生產人溶菌酶蛋白的方法。

背景技術

溶菌酶(lysozyme)學名N-乙酰己糖胺酶，屬于胞壁質酶。溶菌酶廣泛存在于自然界的各種微生物、原生動物、人和動植物組織中。但不同來源的溶菌酶其抗菌譜也不盡相同。溶菌酶在臨床上具有很高的實用價值，它可與血液中的病菌和病毒結合，具有抗菌、抗病毒止血、消腫、加快組織恢復等作用。臨床上可用于慢性鼻炎、急性慢性咽喉炎、口腔潰瘍、水痘、帶狀皰疹和扁平疣等的治療。溶菌酶還是人體內的非特異免疫因子，可提高肌體免疫力。近年來，有關溶菌酶抗腫瘤、抗艾滋病毒的藥理研究也表明，溶菌酶可作為一種較強的免疫調節因子用于預防和治療惡性腫瘤，以及作為一種有效的抗HIV物質用于艾滋病的治療。

但是目前人溶菌酶只要從人奶和胎盤組織中提取，不僅來源有限，而且提取復雜，產量低，還容易受到人疾病的病原菌污染，所以至今仍主要用于科學研究，無法工業化生產供應臨床應用。另外從雞蛋中提取的雞溶菌酶，產量高，來源容易，但由于異種蛋白有較強的過敏反應，不適合用于人體，目前僅限于用做化妝品使用。

通過基因工程的技術手段，利用植物作為生物反應器，大規模生產外源藥用蛋白具有自身的優勢。現有研究表明植物生物反應器生產的外源蛋白產量高，能達到可溶性蛋白的4-5％；生產過程簡單、快速、靈活、成本低；對生產的材料收獲、儲存、運輸方便，無需特殊管理和監控；植物生物反應器生產的外源蛋白能進行正確的轉錄、翻譯和加工，保證了蛋白的功能不受影響；一些植物材料可以直接食用，便于外源蛋白的有效利用。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，利用植物生物反應器的優勢，提供了一種以馬鈴薯為生物反應器大規模生產人溶菌酶的方法。

本發明通過以下技術方案實現：

1.獲取人溶菌酶基因：從人白細胞中提取RNA，反轉錄為cDNA，經PCR反應擴增出人溶菌酶基因。

2.構建植物表達載體：利用pBI121植物表達載體，構建含有人溶菌酶基因的植物表達載體(圖1)。

3.轉化馬鈴薯：通過根癌農桿菌介導的方法將含有人溶菌酶基因的植物表達載體導入馬鈴薯中，得到表達人溶菌酶蛋白的轉基因馬鈴薯植株。

本發明所構建的人溶菌酶基因植物表達載體中，人溶菌酶基因在植物組成型啟動子CaMV?35S啟動子下游，同時包含了來自于細菌的NPTII抗性基因，能賦予轉基因植株卡那霉素抗性。

附圖說明

圖1.人溶菌酶基因hLY植物表達載體

圖2馬鈴薯表達人溶菌酶hLY蛋白SDS-PAGE電泳結果及wenstern雜交結果

具體實施方式

實施例1分離人溶菌酶基因：

從人外周白細胞中提取細胞總RNA，進行RT-PCR反應。根據GenBank公開的溶菌酶基因序列(HSU25677)設計特異性引物：

引物1：5’-GCGGATCCATGAAGGCTCTCATTGTTCT-3’

引物2：5’-GCGAGCTCGCTTACACTCCACAACCTTGA-3’

經94℃4min變性，25個循環94℃30sec，55℃30sec，72℃1min30sec，72℃7min延伸；PCR擴增得到人溶菌酶成熟蛋白的cDNA片段，PCR擴增片段與pGEM-T載體連接并轉化大腸桿菌(Top10)，酶切驗證為陽性的pGEM-hLY克隆送樣測序，經測序分離的hLY偏單序列與公布的人溶菌酶基因序列一致。

實施例2人溶菌酶基因植物表達載體的構建

用BamHI/SacI雙酶切pBI121和pGEM-hLY質粒，分別電泳回收酶切的pBI121載體和hLY外源片段，通過T4DNA連接酶將人溶菌酶基因hLY連入pBI121載體中，得到人溶菌酶的植物表達載體pBI-hLY。

實施例3pBI-hLY質粒轉入農桿菌

采用凍融法轉化農桿菌，取5μl?pBI-hLY質粒加入到200μl?LBA4404農桿菌感受態細胞中，冰浴30min，液氮速凍5min，37℃融化5min。加入1ml?YEB培養基，28℃200rpm振蕩培養2-3h，收集菌體涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和鏈霉素(125mg/L)的YEB平板，28℃暗培養2-3天。挑取單菌落，液體培養后小量制備質粒，酶切驗證，確定pBI-hLY質粒已經轉入農桿菌中。

實施例4農桿菌介導人溶菌酶基因hLY轉化馬鈴薯