[發明專利]一種羅非魚神經肽Y重組蛋白的表達系統

無效

• 申請號: 200910214231.1
• 申請日: 2009-12-25
• 公開（公告）號: CN101824435A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發明（設計）人: 李文笙;王光中
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N1/19;C12N15/12;C07K14/435;C12P21/02;A61K38/17;A61P43/00;A23K1/16;C12R1/84
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及羅非魚神經肽Y蛋白領域，具體涉及一種羅非魚神經肽Y重組蛋白的表達系統。

背景技術

神經肽Y(NPY)是Tatemoto于1982年首次從豬腦中提取的一種含36個氨基酸的單鏈多肽，其開放閱讀框全長300bp，編碼99個氨基酸，其中含有28個氨基酸的信號肽，36個氨基酸的成熟肽和一個功能未知的肽尾，所述36個氨基酸的成熟肽是真正的活性神經肽Y。NPY是一種內源性的促食欲因子，屬胰多肽家族，與兩種腸內分泌肽(胰腺肽和肽YY)具有高度同源性。NPY有2個相互逆平行的螺旋區，1個富含脯氨酸的螺旋和1個螺旋，2個螺旋區都有兩性電離的特點，2個螺旋之間借疏水鍵維持其穩定的三級結構。當NPY的三級結構發生改變時，其生物活性便消失。NPY廣泛分布于中樞及外周神經系統的神經元中，同時也存在于心臟、骨骼肌、肝臟、腎上腺等器官中。大量研究表明，NPY在中樞神經系統能刺激動物攝食，改變機體代謝環境，激活脂肪組織的脂蛋白酶，促進脂肪的合成與儲存。通過在腦室注射和腹腔注射的研究發現NPY具有促進魚類攝食，影響激素分泌、血壓、性行為以及調節體溫和能量平衡等各種生物功能。

羅非魚(Tilapia)，俗稱非洲鯽魚，隸屬于鱸形目、鱸形亞目、麗魚科Cichlidae、羅非魚屬Tilapia(亦稱麗鯛科，麗鯛屬)。該屬原產于非洲，有600多種，目前被養殖的有15種。其外形、個體大小類似鯽魚，屬廣鹽性魚類，海淡水中皆可生存；耐低氧，一般棲息于水的下層，但隨水溫變化或魚體大小改變棲息水層。羅非魚食性廣泛，價格低廉，是世界性的主要養殖魚類，被譽為21世紀窮人的蛋白質，也是中國主要的出口經濟魚類之一。但目前在羅非魚人工養殖中還沒有一種能有效促進其生長的基因工程產品餌料添加劑。

酵母是最簡單的真核生物，以其作為宿主表達外源蛋白有很大的優勢：生長繁殖快，易培養，操作簡單；能對表達的外源蛋白進行翻譯后加工修飾，如糖基化、乙?；龋话踩愿撸瑹o致病性。巴斯德畢赤酵母是一種甲醇營養型酵母，能將甲醇作為代謝的唯一碳源和能源。畢赤酵母表達系統有很多優點在科研及生產中廣泛應用：使用強的可誘導啟動子-AOX1基因啟動子、外源基因以單拷貝或多拷貝定點整合入基因組中，遺傳穩定性好、重組蛋白以高水平分泌到幾乎無蛋白的培養基中，利用表達蛋白的純化、容易進行高密度發酵，適合于產業化生產。

發明內容

本發明的目的在于根據現有技術的不足，提供一種羅非魚神經肽Y重組蛋白的表達系統。

本發明目的通過以下技術方案予以實現：

一種羅非魚神經肽Y重組蛋白的表達系統，包括表達載體和重組株，該表達系統是將帶酶切接頭的羅非魚神經肽Y基因克隆入畢赤酵母表達載體中得到重組畢赤酵母表達載體，再將重組畢赤酵母表達載體轉化入畢赤酵母感受態細胞，得到畢赤酵母重組株，該重組株表達羅非魚神經肽Y重組蛋白。

上述表達系統中，所述帶酶切接頭的羅非魚神經肽Y基因的合成方法是以羅非魚神經肽Y克隆入載體pTZ57R/T中，以其為模板設計三個引物，上游引物A含有XhoI酶切位點，如SEQ?ID?NO：1所示；下游引物B含有XbaI酶切位點和6×His標簽序列，如SEQ?ID?NO：2所示；下游引物C含有XbaI酶切位點，不含6×His標簽序列，如SEQ?ID?NO：3所示；通過PCR方法得到兩段帶有不同酶切接頭的羅非魚神經肽Y基因。其中，含有6×His標簽序列的下游引物B在6×His標簽序列后面加TGA終止密碼子以阻止pPICZA載體自身的標簽表達，不含有6×His標簽序列的下游引物C不添加終止密碼子，只表達pPICZA載體自身的6×His和myc標簽。

A與B、A與C通過PCR方法得到兩段帶有不同酶切接頭的羅非魚神經肽Y基因。將這兩段基因序列分別克隆入畢赤酵母表達載體中，得到兩個重組畢赤酵母表達載體D和E。兩個重組畢赤酵母表達載體D和E分別轉入畢赤酵母X-33感受態細胞中，經培養得到的兩個畢赤酵母重組株F和G。

本發明羅非魚神經肽Y重組蛋白，是由表達系統中的兩個畢赤酵母重組株F和G經發酵培養、分離純化得到的。這兩種蛋白產物所連接的標簽不同，一個為6×His，另一個為6×His和myc標簽加上兩間隔氨基酸序列，即目的蛋白序列與6×His標簽序列之間的序列和6×His和myc兩標簽之間的序列。

本發明羅非魚神經肽Y重組蛋白的生產方法為：將畢赤酵母重組株接種在含有BMGY的培養基中培養，離心收集菌體并重懸于YPM培養基中培養，收集上清，經分離純化后得到羅非魚神經肽Y重組蛋白。