[發明專利]鋸緣青蟹雙順反子病毒結構蛋白2及其單克隆抗體和應用

無效

• 申請號: 200910213701.2
• 申請日: 2009-12-08
• 公開（公告）號: CN101717436A
• 公開（公告）日: 2010-06-02
• 發明（設計）人: 張銳;翁少萍;何建國;蘇鴻君;董傳甫
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C07K14/08
• 分類號: C07K14/08;C12N15/40;C07K16/10;G01N33/577;C12R1/93
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及青蟹養殖生物技術領域，尤其涉及鋸緣青蟹雙順反子病毒結構蛋白2及其單克隆抗體和應用。

背景技術

鋸緣青蟹(Scylla?serrata，學名為Mud?crab)，俗稱青蟹，主要分布于印度洋-太平洋的熱帶、亞熱帶海域，是經濟價值很高的食用蟹類，為名優養殖品種之一。

病毒病是鋸緣青蟹養殖過程中的主要病原，其造成青蟹養殖業的嚴重經濟損失，因此鋸緣青蟹養殖過程中，對各類病毒病的研究是當前的重要課題。

2004年始在珠海發現患“嗜睡病”(SD)的鋸緣青蟹同時存在兩種病毒：鋸緣青蟹雙順反子病毒(Mud?crab?dicistrivirus，MCDV)和呼腸孤病毒(mudcrab?reovirus，MCRV)。

MCDV是水生甲殼動物中發現的單股正鏈RNA病毒ssRNA(+)，其單獨存在就可以使鋸緣青蟹致病，而且死亡率可達80％以上，因此對MCDV的感染機制和致病性進行研究，在青蟹養殖業中及時監測MCDV的發病情況，尋找有效的預防和防治方法，是當前鋸緣青蟹養殖需要解決的重要問題。

雙順反子病毒(dicistrivirus)是一個新分類的病毒屬，隨著海洋病毒學的不斷深入，越來越多的水生生物的雙順反子病毒被發現，但是其結構蛋白還未見研究，有關鋸緣青蟹雙順反子病毒(MCDV)的結構蛋白的研究也未見有相關報道。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種鋸緣青蟹雙順反子病毒的結構蛋白2。

本發明的另一個目的在于提供上述鋸緣青蟹雙順反子病毒結構蛋白2的單克隆抗體。

本發明的另一個目的在于提供上述單克隆抗體在制備檢測MCDV病毒試劑盒或膠體金試紙中的應用。

本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的：

本發明人從同時存在于鋸緣青蟹的兩種病毒(MCDV和MCRV)中分離純化出MCDV，電鏡觀察發現其直徑為20～30nm，球形，無囊膜，呈二十面體對稱，在CsCl中的浮力密度為1.32～1.36g/cm³，核酸性質分析發現此病毒基因組為單股正鏈RNA病毒ssRNA(+)。

本發明人對MCDV的基因組分析發現其包含有被基因間非編碼區(IGR)隔開的兩個開放讀碼框ORF1和ORF2，其中，ORF1編碼非結構蛋白，ORF2編碼結構蛋白。

本發明人對ORF2進行進一步地研究發現，ORF2由三個結構蛋白組成，分別是分子量為53KD的結構蛋白1(簡稱VP1)、分子量為35KD的結構蛋白2(簡稱VP2)和分子量為22KD的結構蛋白3(簡稱VP3)。

接著，本發明人對結構蛋白2進行了一系列的研究分析，如下所示：

1、氨基酸序列及其編碼核苷酸序列

結構蛋白2的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；

編碼結構蛋白2的核苷酸序列，如SEQ?ID?NO：1所示。

2、單克隆抗體的獲得

本發明人首先采用全病毒(MCDV)作為抗原，進行體內免疫試驗，然后采用HAT與HT選擇雜交瘤細胞、間接ELISA法篩選陽性單克隆抗體，接著利用Western?blot方法從陽性單克隆抗體中將結構蛋白2的單克隆抗體篩選出來，最終獲得能識別MCDV結構蛋白2的單克隆抗體。

3、結構蛋白2的定位

本發明人在MCDV病毒分離純化的基礎上，對其三個結構蛋白的N端氨基酸進行了測序，并與MCDV的基因組序列對比和結構分析，在MCDV基因組中找到了三個結構蛋白的相應位置。

為了進一步對結構蛋白2精確定位，本發明人采用免疫電鏡方法，觀察上述Western?blot結果中，結構蛋白2的單克隆抗體所識別的抗原決定簇的位置，電鏡結果顯示，該抗原決定簇定位于病毒粒子的邊緣，從而實現了對MCDV結構蛋白2的精確定位。

本發明篩選到的MCDV結構蛋白2的單克隆抗體可用于MCDV的感染機制和致病性研究，用于青蟹養殖業中及時監測MCDV的發病情況，用于鋸緣青蟹雙順反子病毒(MCDV)活體的中和作用，以及用于制備體外檢測樣品中是否存在MCDV病毒的試劑盒或膠體金試紙條。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

1.本發明通過對MCDV進行研究分析，首次獲得其結構蛋白2的氨基酸序列、核苷酸序列和單克隆抗體，并對該結構蛋白2進行了定位，為鋸緣青蟹的病毒病研究提供了新的研究方向；

2.本發明篩選到結構蛋白2的單克隆抗體可用于MCDV監控和檢測的多個方面。

附圖說明

圖1為實施例1中純化MCDV的SDS-PAGE電泳圖；